MTT法测定聚乙烯亚胺
实验十五 MTT法测定聚乙烯亚胺（PEI）的细胞毒性
实验导读
毒性是外来化合物对机体造成损害的能力。外来化合物是指存在于外界环境中，可能与机体接触并进入机体的一些化学物质。外来化合物并非机体的组成成分，也非机体所需的营养物质，而且也不是维持机体正常生理功能和生命所必需的物质，但它们可由外界环境通过一定的环节和途径与机体接触并进入机体，在机体内呈现一定的生物学作用。常见的外来化合物有农用化学品、工业化学品、药物、食物添加剂、日用化学品、各种环境污染物及霉菌毒素等。毒性较高的物质，只要相对较小的数量，就可对机体造成一定的损害；而毒性较低的物质，则需要较多的数量，才呈现毒性。物质毒性的高低仅具有相对意义。在一定意义上，只要达到一定数量，任何物质对机体都具有毒性；在一般情况下，如果低于一定数量，任何物质都不具备毒性；关键是此种物质与机体接触的量。除物质与机体接触的数量外，还与物质本身的理化性质以及其与机体接触的途径有关。以目前的技术手段在体外很难全面监控化学物质引起的全身效应，因此大多数试验都是测定细胞水平的效应，即细胞毒性（cytotoxicity）。这些试验简化了化学物质针对的对象，体外的细胞实验又缺乏神经和体液的调节，因此只是一定程度的近似，但是细胞水平的实验经济、易于量化而且重现性高，所以被广泛应用。
将化学物质加入到处于指数生长期的细胞中共孵育一段时间，然后将化学物质换成正常培养液继续培养，让细胞再增殖2－3个群体倍增时间，这样就可以把能够增殖的存活细胞和那些被化学物质毒性损伤后不能增殖的存活细胞区别开来，然后用MTT染料还原反应测定存活细胞的数目，这样，就能检测化学物质对细胞造成的损伤。
聚乙烯亚胺（PEI）是一种聚阳离子材料，广泛应用于基因转染实验，其在细胞中的转染效率依赖于分子量的大小，一般来说，分子量高于25KD时，PEI具有很高的细胞转染效率，但细胞毒性也较高，相反，分子量低于2KD时，PEI几乎没有转染效率，但毒性也比较低。本实验通过两种不同分子量的PEI（25KD和600）在Cos7细胞株进行细胞毒性实验，以比较两种材料的细胞毒性。
一、实验目的
1．掌握细胞毒性测试的原理
2．熟悉细胞毒性测试的方法
二、实验原理
四唑盐比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法。显色剂四唑盐是一种能接受氢原子的染料，化学名是3－（4，5－二甲基噻唑－2－2，5－二苯基四氮唑嗅盐，商品名是噻唑篮，简称为MTT。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。该方法已经广泛应用于一些生物活性因子的活性检测，大规模的抗肿瘤药物筛选，细胞毒性试验及肿瘤放射感性测定等。它的特点是灵敏度高、重复性好、操作简便、经济、快速、易自动化、无放射性污染，与其他检测细胞活力的方法（如细胞计数法，软琼脂克隆形成试验和3H-TdR掺入试验等）有良好的相关性。
三、仪器和试剂
仪器：酶标仪（BIO-RAD 680，配有570nm的滤光片），微量震荡器（用于震荡96孔板），细胞培养用的常规仪器。
试剂：
（1）Cos-7细胞：于实验前稳定培养，确认细胞状态良好，并于实验前一日细胞瓶中细胞约长满70％－80％左右。
（2）MTT溶液：称取250mgMTT放入小烧杯中，加入50mL PBS(0.01mol/l，PH7.4)，搅拌30min，用0.22m滤器除菌，分装，4℃保存，2周内有效（5mg/mL）。
（3）DMSO（二甲基亚砜）
（4）聚乙烯亚胺PEI25KDa和PEI600配成1 mg/mL和10 mg/mL两种浓度（0.02MPBS作为溶液，PH7.4）。
四、实验步骤
1．细胞接种，用0.25%胰蛋白酶消化单层Cos-7细胞，用含10%胎牛血清的1640培养液配成单个细胞悬液，将细胞接种到96孔板上，8000细胞/孔，每孔体积200µL。
2．细胞培养，将培养板放入CO2孵箱，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，培养至细胞贴壁而未进入分化阶段（一般为
3．吸去培养液，用PBS清洗细胞，加入无血清培养液，在细胞孔中分别加入PEI溶液，让每孔中PEI的浓度分别为5，10，25，50，75，100，150，200µg/mL，每孔液体的总体积在200µL。（注意每种浓度都为三复孔，并要有不加任何PEI的对照孔至少3孔）
4．PEI溶液与细胞共孵育3h。
5．吸去培养液，每孔加入90 l 无血清培养液和10 l的5mg/mL MTT溶液，37℃孵育3h。
6．翻板法弃去液体，每孔加入100 l DMSO，在震荡器上震荡10min。
7．在酶标仪上570nm波长测OD值。
8．细胞活力的计算式：
细胞活力 = 每孔样品OD值/每孔对照组OD平均值×100％
9．统计数据。
五、数据记录与处理
1．观察PEI25KDa和PEI600的细胞死亡情况。用细胞活力计算细胞活力。
2．以PEI浓度为横坐标，细胞存活百分率（%）为纵坐标进行绘图。
注意事项
1．实验时应该观察细胞的生长状况，选择适当的细胞接种浓度，一般情况下，96孔培养板的一个孔内贴壁细胞长满时约有105个细胞。实验选择的接种浓度能保证MTT结晶形成的量与细胞数为良好的线性关系，因此，细胞板的接种与实验开始的时间间隔不宜超过16h，以免细胞过早进入指数生长期从而干扰实验结果。
2．避免血清的干扰。细胞培养时一般选择10%的牛血清培养液进行孵育，
在加入化学物质前，要尽量吸尽培养孔中残余的培养液。
3．设空白对照，与实验孔平行设置不加细胞只加培养液的空白对照组。进行比色测定时，以空白孔为零值。
六、思考题
1．毒性的定义很广泛，你能举出身边遇到的关于化学物质毒性的例子吗？
2．如何用细胞记数法，计算细胞悬浮液中细胞的浓度？
参考文献
1 司徒镇强，吴军正。细胞培养。北京：世界图书出版公司，2006。
2 李永明，赵玉琪。实用分子生物学方法手册。北京：科学出版社，2000。 3 Cheol-Hee Ahn, Su Young Chae, Sung Wan Kim Biodegradable poly (ethylenimine) for plasmid DNA delivery. Journal of Controlled Release.2002,(80):273-282
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（汤谷平 周峻）