葡萄糖异构酶的生物工程研究进展

2000;27(2)　　　　生物化学与生物物理进展　　Prog.Biochem.Biophys.・127・

综述与专论

葡萄糖异构酶的生物工程研究进展

朱国萍　程　阳　宫春红　徐　冲1

)

(中国科学技术大学生命科学学院,合肥)

3

摘要　D2葡萄糖异构酶(GI)能分别催化D2.浆的关键酶.在GI2至C1间负氢离子转移的GI异构化作用、.、测序和超量表达.经过蛋白质工程改造的GI.

关键词　葡萄糖异构酶,高果糖浆,蛋白质工程学科分类号　Q558

　　葡萄糖异构酶(glucoseisomerase,GI)又称D2木糖异构酶(D2xyloseisomerase).1957年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性.后来有近百种细菌和放线菌被鉴定为产GI的菌株.这些菌株GI大都是胞内酶,极少数菌株产胞外酶,如我国7号淀粉酶链霉菌M1033菌株(S.M33GI)[1].1967年美国首次成功地进行了GI工业化应用.至今西方主要的淀粉加工业都已转向GI技术.另外耐热的GI结构非常稳定,是目前国际上公认的研究蛋白

糖以及葡萄糖C23、C25和C26的修饰衍生物为催化底物.但是GI只能催化D2葡萄糖或D2木糖α2旋光异构体的转化,而不能利用其β2旋光异构体为底物.113　最适pH和最适温度

　　GI的最适pH通常微偏碱性,在710～910之间.在偏酸性的条件下,大多数种属的GI活力很低.GI最适反应温度一般在70～80℃,这决定于缓冲液、底物浓底、激活剂、稳定剂及反应时间等条件.

114　金属离子的影响

质结构与功能关系、建立完整的蛋白质工程技术最好的模型之一[2].

　　GI的活力及稳定性跟二价金属离子有重大关系.Mg2+、Co2+、Mn2+等对该酶有激活作用,Ca2+、Hg2+、Cu2+等则起抑制作用.金属离子还

1　葡萄糖异构酶的生物学性质

　　GI能催化D2葡萄糖至D2果糖的异构化反应,

它是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆(highfructosecornsyrup,HFCS)的关键酶[3],且该酶

影响GI对不同底物的活性.如凝结芽孢杆菌GI和Mn2+结合时对木糖的活性最高,和Co2+结合时对

葡萄糖的活性最高.

可将木聚糖异构化为木酮糖,再经微生物发酵生产乙醇.

111　热稳定性

2　空间结构特点

211　序列比较

　　乳酸杆菌和埃希杆菌GI的热稳定性较差.链霉菌和枯草芽孢杆菌GI在高温下相当稳定.嗜热高温菌(Thermusthermophilus)GI的热稳定性最高,可能是它对Val及Pro等氨基酸的偏爱选择,使其具有更紧密的空间结构.而这些氨基酸在其他GI中则被替代[4].112　底物专一性

　　GI的序列同源性在相近种属中较高.深灰色链霉菌与紫黑链霉菌GI的序列同源性为8616%,密苏里游动放线菌和小瓶属菌株GI达9314%.但大肠杆菌和枯草杆菌GI与链霉菌的同源性仅为2412%和2613%,且G+C含量也明显低于其他种

　3国家“863”高技术项目([1**********]4).

1)

　通讯联系人,中国科学技术大学生命科学学院.

　　GI除了D2葡萄糖和D2木糖外,还能以D2核糖、L2阿拉伯糖、L2鼠李糖、D2阿洛糖和脱氧葡萄

　Tel:(0551)3606354,E2mail:[email protected]　收稿日期:1999202201,修回日期:1999208202

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属.在已知GI的序列中,除了活性部位的14个氨基酸全保守外,还有其他25个氨基酸也相同[5].212　亚基组成　　不同来源的GI在晶体中均以紧密的四聚体形式存在.单体分子质量为40～50ku.单体间符合222点群对称分布.每个单体分两个结构域[4].N

α端的主结构域由8股α/β桶(/βbarrel)构成,它

包含两个同轴圆柱,内圆柱由8条平行的β折叠片构成,外圆柱由8股与β折叠片交替相邻的α螺旋构成,α螺旋的肽链走向与β.α端的环状结构,的构成.

213　活性中心结构及活性形式

微弱或没有活性,只有形成四聚体时,它才有全部

的酶活.

3　葡萄糖异构酶的作用机理

311　烯二醇中间体催化机制

　　此催化机制首先提出底物是以开环方式与酶结合的.H54C1相互作用.底物O1和O2,.,如;底物分子内质子从C1转至C2不具明显的溶剂交换等.312　负氢离子转移机制　　晶体学和酶动力学的证据表明,GI是采用金属离子介导的负氢离子转移机制[8,9](图1).关于负氢离子转移中间体形式,有两种看法.一种是阳离子形式,在异构化过程中,Mg22极化底物C1的羰基产生碳正离子,Mg21和K183作为路易斯酸稳定碳正离子,同时两个金属离子稳定O2的负电荷[10].另一种是阴离子形式,提出与底物的O1、O2和D257的羧基形成氢键并与催化离子Mn2+配位的水分子,将质子转移给D257的CO1而自身形成

OH-离子,此OH-离子夺取底物的质子使其带负电

　　每个单体一个深陷的口袋状GI活性中心,位于平行β桶的近C端口部.每个活性中心包含M1和M2两个二价金属离子结合位点[6].结构离子M1与E180、E216、D244及D286的羧基氧原子成四配位;催化离子M2与活性部位的E216、D254及D256的羧基氧原子、H219咪唑基团及一

个溶剂分子的氧原子配位成键,M2在异构化过程中位置偏离原处011nm左右.E216是与M1、M2配位的桥梁.在上述氨基酸构成的极性区域外015～018nm范围内,有保守的疏水残基F93、W15、W136和F25′形成“高度疏水背景”(highhydro2phobiccontrast)[7].由于F25′来自不对称的一个单体,因此认为溶液中GI首先聚成二聚体,但活性

荷,其质子转移是由水分子/氢氧根离子完成的.Hu

等[11]认为在负氢离子转移之后,是K183的

NH3+基团提供质子给底物O1以形成羟基基团.

图1　葡萄糖异构酶的催化机制

(a)酶与二价金属离子M1结合;(b)酶与底物结合;(c)底物开环,C1上的氢原子转移到O5上形成OH-;(d)底物开环

的链伸展;(e)M2位置偏离至M2′位置,发生底物C2至C1间的氢负离子转移;(f)异构化反应结束,M2′回到M2位置;

(g)开环的底物链在H54的催化下闭环产生D2酮糖;(h)酶释放D2酮糖,催化过程结束.

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4　D2木糖操纵子的基因组织及调控

411　沙门氏菌

(xylR)的阅读框,xylA和xylB基因转录方向相

同,但具体的调控机制不清楚.在锈赤链霉菌

(S.rubiginosus)中,xylA和xylB基因相邻,但分开转录,方向相反.xyl基因的转录受到木糖的诱导和葡萄糖的阻遏.对嗜热菌Thermoanaero2bacterethanolicus的研究也显示,GI对木糖的利用受到阻遏蛋白2操纵子机制的调控[12].

　　在沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)中,组成D2木糖操纵子(xyloperon)的基因分别是:运送木糖穿过细胞膜的透性酶基因xylT;木糖异构酶基因xylA;木酮糖激酶基因xylB;转录的重要调节元件xylR.其基因顺序是xylA→xylB→xylR(T).调节子中有二个启动位点,一个靠近

xylT,另一个靠近xylB.xylR5　15:GI基因已在E.coli中获得超量

木糖结合后,、和xylT.412　大肠杆菌　　E.coli中D2木糖操纵子的xylA和xylB及其调控元件位于E.coli染色体80min处.它的基因顺序是xylB→xylA→xylR(T),xylA、xylB、

xylT基因的表达受到xylR基因产物的调控:当

表达.GI结构基因与强启动子lac或tac的融合可导致该酶20倍的超表达,将其连接入含强启动子

PL质粒的下游,也可超量表达.在tac启动子控

制下,xylA基因表达的GI占细胞总蛋白量的28%.含有GI基因的E.coli还可封装在藻酸钙的

缺乏木糖时,三种基因的表达受到抑制;当木糖存在时,则被激活.xylR表达产物同阿拉伯糖调节子中araC基因产物的功能类似.E.coli的D2木糖操纵子受葡萄糖的抑制,加入cAMP可解除抑制.413　枯草杆菌属　　枯草杆菌(B.subtilis)的D2木糖操纵子可能是转录水平上的负控制体系.xylA与xylB基因位于染色体上的相邻位点.xylR与xylA基因的转录方向相反.在串联的xyl调节区中存在2个阻遏蛋白的结合位点.操纵基因可能通过29～48氨基酸间的一段α螺旋2转折2螺旋结构识别xylR序列.木糖可诱导GI的表达,但无木糖时,由于可溶性反式因子的阻遏作用,表达受到抑制.414　葡萄球菌属

　　在葡萄球菌(Staphylococcus)中,木糖操纵子的开放阅读框依次为xylR→xylA→xylB.xylR转录的同时xylA被木糖诱导.xylR和xylA两个转录单元被一个转录终止子隔开,在两个转录起始点的上游都有类似启动子的序列.xylA和xylB仅间距5个核苷酸.由于xylA和xylB之间缺乏终止子结构,所以它们可能是同时转录.另外鉴于xylB的SD序列(AAGGA)与xylA最后的密码子重叠,因而认为它们也是同时翻译的.415　链霉菌属及其他菌属　　链霉菌的D2木糖操纵子的研究不多.在紫黑链霉菌(S.violaceniger)中,存在一个调节蛋白

小珠子中,用于异构化底物的反应柱.51112　链霉菌:在变铅青链霉菌中,同源克隆来自暗色链霉菌(S.phaeochromogenes)的GI,结果GI活性大幅提高.为避免无选择压力下,由于质粒的不稳定而导致GI表达不稳定,还可将链霉菌启动子P1克隆到xylA上游,再将P12xylA基因通过整合载体pTS55整合入染色体.整合菌株CBS1在无糖条件下,GI活性7倍于需木糖诱导的野生型GI.

512　GI基因在异源宿主中的表达

51211　大肠杆菌:E.coli是最常用的异源宿主菌.以地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)染色体的

EcoRⅠ片段克隆入pBR322,再转化GI缺陷型E.coli菌株,得到含有GI基因的重组质粒十分稳

定,其酶活比野生型高20倍.在E.coli中获得克隆和表达的还有小瓶属3876菌株、嗜热高温菌及S.M33GI等[13].51212　其他细菌宿主:来自E.coli的GI基因通过双功能质粒被克隆入枯草杆菌,但未表达.嗜热产硫梭状芽孢杆菌的GI基因通过E.coli2枯草杆菌穿梭载体被克隆入枯草杆菌,其表达量明显高于亲本菌株.

51213　酵母菌:粟酒裂殖酵母(Schizosaccha2romycespombe)能耐受高浓度乙醇且发酵产率高,将E.coli的GI基因通过穿梭载体导入其中获表达,GI能发酵10%的木糖为3%的乙醇,且副产物木糖醇对GI活性没有影响.将枯草杆菌GI基因融合酵母GAL1启动子,其转化菌株只产生GI

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特异性mRNA而无酶活.酵母蛋白酶的水解和木糖发酵的有限步骤导致GI活力较低.51214　植物:将E.coli的GI基因克隆到pBR322上,转化烟草叶盘,结果获得GI基因表达的转基因烟草.GI基因也成功地克隆入马玲薯和番茄中,通过检测GI活力验证了xyl基因的存在[14].

614　重要氨基酸残基及金属离子的功能

　　Jenkins等通过对AMGI的底物和金属离子结合位点的定点突变研究提出,M1参与环状底物分子结合,并稳定底物形成开环中间体.M2稳定开环中间体.K183参加开环反应.H54和H220对异构过程十分重要.H54对异构反应的转移态稳定也很重要,.

6　定点突变改造葡萄糖异构酶

611　改善热稳定性

71　　Mrabet构建的密苏里游线(Actinplsnes体K253R,其半延1550h.三点K309R/K319R/K323R在60℃时的半衰期是野生型的3倍.最稳定的突变体G70S/A73S/G74T则是通过加强活性二聚体界面

,葡萄糖转化率约50%,而工业应用要求果糖含量高于50%,提高反应温度及降

低反应pH可增加果糖得率.单一pH过程(uni2αpHprocess)即指HFCS生产中的玉米淀粉、2淀粉酶及脱支酶的液化、糖化和异构化在同一pH下进行,约为415～510,因此酸、热稳定的GI能减少高温下有色碳酰副产物的生成,提高HFCS生产效益[20].

712　木糖异构化及发酵的同步性

的相互作用而改善了热稳定性.

　　S.M33GI突变酶G138P和G138P/G247D的热稳定性也有大幅提高.G138P的半衰期提高1倍,而G138P/G247D在80℃时较G138P更为稳定.蛋白质结构模拟显示Pro有较小的构型自由度,其吡咯烷环可使β转折或无规卷曲结构更稳定,增加了蛋白质空间结构的刚性,从而提高了热稳定性[16].612　降低最适pH　　AMGI突变体E186Q,其最适pH比野生型下降1个单位,在Mn2+条件下,由719降为6125[17],且活性提高2倍.锈赤链霉菌的D56N和E221A突变体酶,当pH从815～818降至6～715时,酶活提高40%[18].S.M33GI的突变酶G247D的最适pH下降了016个pH单位,且酶活提高33%,但在高温下不稳定.613　改变底物专一性,提高催化效率

　　嗜热产硫梭状芽孢杆菌GI的定点突变体W139F,其Km降低,Kcat升高.双突变体W139F/V186T及W139F/V186S的催化效率则也

[15]

　　平衡时木酮糖与木糖的比率只有1∶5,所以木糖的同步异构及发酵(simultaneousisomerizationandfermentationofxylose,SIFX)更优先考虑异构

化条件.木酮糖由酵母发酵为乙醇的同时,也更易于木糖向木酮糖的转化平衡.适宜于SIFX的pH为515或610,乙醇是最终产物.SIFX的得率不高可能与酶量不足及木糖、木酮糖、乙醇的抑制有关,因此发酵系统有待改进.

　　蛋白质工程技术已可以将各种优势集中于单一工程菌.目前期望通过现代生物技术获得性质改善的理想GI,以降低生产成本,简化工艺流程.科学家预计通过蛋白质工程改造的GI将成为最重要的工业用酶之一.

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thermostablexyloseisomerasesfromThermuscaldophilusandThermusthermophilus:possiblestructuraldeterminantsof

分别高于野生型酶5倍和2倍.W139是位于底物结合处的氨基酸,这说明底物特异性可以通过提高活性部位的底物结合口袋对葡萄糖的氢结合能力而得以改变.

　　S.M33GI双突变酶G247D/G138P的酶活比野生型提高45%.这可能因为D247附近活性残基的侧链均伸向活性中心,而D247的侧链向外伸展且电负性很强,改变了活性部位的电荷传递过程,而使酶活提高[19].

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UniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026,China).

Abstract　D2glucoseisomerase(GI)canisomerizeD2glucoseandD2xyloseintoD2fructoseandD2xylulose,respectively.Itisacrucialenzymeintheproductionofhighfructosecornsyruponindustrialscale.InthehydrideshiftmechanismproposedforGI,themainfeaturesareringopeningofthesub2strate,isomerizationofGIviaahydtrideshiftfromC2toC1,andringclosureoftheproduct.GIgenehasbeencloned,sequencedandoverexpressedinthehomologousandheterogoushosts.GIwhoseproper2tieshavebeenimprovedbyproteinengineeringmaybeoneofthemostimportantindustrialenzymesofthefuture.

Keywords　glucoseisomerase,highfructosecornsyrup,proteinengineering

血管内皮细胞生长因子研究进展

肖　扬　焦炳华1)　缪辉南

(第二军医大学基础部,上海200433)

摘要　从不同侧面阐述了血管内皮细胞生长因子(VEGF)在新生血管形成中的作用.VEGF诱导新生血管形成,具有血管渗透性,是新生血管形成的主要调控者之一.VEGFmRNA不同剪接,形成5种VEGF变异体

(isoform)即VEGF1212206.VEGF诱导新生血管的调控过程、拮抗VEGF成为大家竞相研究的领域.

1)

　通讯联系人(第二军医大学基础部分子毒理教研室).　Tel:(021)65493936,E2mail:[email protected]　收稿日期:1999202205,修回日期:1999207220