生物化学问答题
生物化学问答题
(1)试举例比较蛋白质、核酸各自结构与其功能的相互关系。
血红蛋白由4个亚基(多肽链)组成,每个亚基都有一个血红素基。血红蛋白以两种可以相互转化的构象态存在,称T (紧张态)和(R 松弛)态。T 态是通过几个盐桥稳定的,无氧结合时达到最稳定。氧的结合促进T 态转变为R 态。氧与血红蛋白的结合是别构结合行为的一个典型例证。T 态和R 态之间的构象变化是由亚基—亚基相互作用所介导的,它导致血红蛋白出现别构现象。Hb 呈现出3种别构效应。
第一,血红蛋白的氧结合曲线是S 形的,这意味着氧的结合是协同性的。氧与一个血红素结合有助于氧与同一分子中的其他血红素结合。
第二,H+和CO2促进O2从血红蛋白中释放,这是生理上的一个重要效应,它提高O2在代谢活跃的组织如肌肉中的释放。相反地,O2促进H+和CO2在肺泡毛细血管中的释放。H+、CO2和O2的结合之间的别构联系称为Bohr 效应。
第三,血红蛋白对O2的亲和力还受2、3-二磷酸甘油酸(DPG )调节,DPG 是一个负电荷密度很高的小分子。BPG 能与去氧血红蛋白结合,但不能与氧合血红蛋白结合。因此,BPG 是降低血红蛋白对氧的亲和力的。 氧的S 形曲线结合,波尔效应以及DPG 效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效应。同时由于能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能,因此使肌体的氧水平不致有很大的起伏。此外血红蛋白使肌体内的pH 也维持在一个较稳定的水平。血红蛋白的别构效应充分地反映了它的生物学适应性、结构与功能的高度统一性。
(2)试述G 蛋白信号转导系统的作用机理
G 蛋白即GTP 结合蛋白,亦称核苷酸调节蛋白(N 蛋白),是一种与膜受体偶联的异三聚体结合蛋白,其具有与GTP 结合并催化GTP 水解成GDP 的能力,由α、β、γ三个亚基组成,充当细胞膜上受体和靶酶之间的信号传递体。另外还发现一种分子量较小的“小G 蛋白(small GTP-blinding protein)”,其特点是它们都是单体,存在于不同的细胞部位,在细胞信号传递中也扮演着重要角色。
G 激素蛋白信号转导系统的作用机理有两种:一是各种含氮激素作为第一信使与靶细胞膜中的特异受体结合,使G 蛋白活化,进而再使cAMP 酶活化,催化ATP 形成cAMP ,作为第二信使的cAMP 经一系列的相关反应级联放大,即先激活细胞内的蛋白激酶A (PKA ),再进一步诱发各种功能单位产生相应的反应,cAMP 起着信息的传递和放大作用;即跨膜信号传送。二是激素通过结合到细胞表面的激素受体上,激活G 蛋白,G 蛋白开启磷酸肌醇酶的催化活性,通过导致磷酸肌醇的级联放大而起作用,从而在许多种细胞种引起广泛的不同反应。在磷酸肌醇酶催化下先产生二酰基甘油(DAG )和肌醇三磷酸(IP3)。DAG 进一步活化蛋白激酶C (PKC ),促使靶蛋白质中的苏氨酸残基与丝氨酸残基磷酸化,最终改变一系列酶的活性;IP3则打开Ca2+通道,升高细胞质内Ca2+浓度,改变钙调蛋白和其他的钙传感器的构象,使之变得更易于与其靶蛋白质结合改变;即胞内信号传送。
(3)DNA 半保留复制的机理是通过哪些重要实验证明的?该复制方式的揭示有何重要意义?
1958年Meselson 和Stahl 利用氮的同位素15N 标记大肠杆菌DNA ,首先证明了DNA 的半保留复制。他们让大肠杆菌在以15NH4Cl 为唯一氮源的培养基上生长,连续培养12代,从而使所有DNA 都标记上15N 。15N-DNA 的密度比普通14N-DNA 的大,在氯化铯密度梯度离心时,这两种DNA 形成不同的条带。如果将15N 标记的大肠杆菌转移到普通培养基(含14N 的氮源),经过一代后,所有DNA 的密度都介于15N-DNA 和14N-DNA 之间,即形成了一半含15N 一半含14N 的杂合分子;两代后14N 和14N —15N 杂合分子等量出现。若现培养,可以看到14N 分子增多。当把14N —15N 杂合分子加热时,它们分成14N 链和15N 链。这就充分证明了,在DNA 复制时原来的DNA 分子被分成了两个亚单位,分别构成子
代分子的一半,这些亚单位在经过很多代后仍然保持完整。
1963年,Cairns 用放射自显影的方法第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA 。他用这种方法阐明了大肠杆菌染色体DNA 是环状分子,并以半保留的方式进行复制。 DNA 的半保留复制机制可以说明DNA 在代谢上的稳定性。经过许多代的复制,DNA 的多核苷酸链仍可保持完整,并存在于后代而不被分解掉。DNA 与细胞其他成分相比要稳定得多,这和它的遗传功能是相符合的。但是这种稳定性是相对的,DNA 在代谢上并不是完全惰性的物质。在细胞内外各种物理、化学和生物因子的作用下,DNA 会发生损伤,需要修复;在复制和转录过程中DNA 也会有损耗,而必须更新。从进化的角度看,DNA 更是处于不断的变异和发展之中。
(4)为什么分子筛层析和SDS-PAGE 都可用蛋白质分子量的测定,其原理有何不同?因为不同的蛋白质,由于分子量不同,其分子大小、形状和所带电荷也不同,因此可以用分子筛层析和SDS-PAGE 法测定其分子量。
分子筛层析也称凝胶过滤法, 其原理是:当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外;比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离,大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。从凝胶过滤的原理可知,蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量,而是它的斯托克半径。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度,则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径,称蛋白质分子的斯托克半径。因此利用凝胶过滤法测定蛋白质相对分子质量时,标准蛋白质和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的结果,分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质,则不能用此方法测定分子量。
SDS-PAGE 也称SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,其原理是:以聚丙烯酰胺为支持物,用十二烷基硫酸钠(SDS )将蛋白质变性,由于蛋白质所带电荷、形状和大小不同,在电场作用下其迁移速率也不同,可以根据这些性质测定蛋白质的分子量。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂SDS 和少量巯基乙醇,则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与原来所带的电荷和分子形状无关。SDS 是一种有效的变性剂,它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用,而巯基乙醇能打开二硫键,因此在有SDS 和巯基乙醇存在下,单体蛋白质或亚基的多肽链处于展开状态。由于SDS 是阴离子,使多肽链覆盖上相同密度的负电荷,该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别,结果所有的SDS —蛋白质复合体,电泳时都以同样的电荷/蛋白质质量比向正极移动。SDS 凝胶电泳可看成是以电场为驱动力代替溶剂流动。而且SDS 改变了蛋白质单体分子的构象,不同蛋白质的SDS 复合体的短轴长度都是一样的。
(5)核酸杂交技术的理论基础是什么?举例说明其在生命科学研究中的作用
核酸由磷酸、碱基和戊糖组成,分DNA 和RNA ,分别有四种碱基,DNA 为A 、T 、C 、G ,RNA 为A 、T 、U 、G 。A 与T 、C 与G 、A 与U 配对,形成氢键,而且核酸具有变性和复性的性质,因此将不同来源的DNA 放在试管里,经热变性后,慢慢冷却,让其复性。核酸杂交的实质是以DNA 变性和复性为理论基础的。若这些异源DNA 之间在某些区域具有相同的序列,则在复性时,会产生杂交DNA 分子。与互补的RNA 之间也可能发生杂交。分子杂交是分子生物学研究的重要方法。
在科学研究中的应用:①亲缘关系的检测;②构建DNA 分子的遗传圈,以进行目的基因的序列测定,满足基因克隆的特殊要求;③了解和掌握DNA 分子中基因编码区的大小和位置;④核酸定量测量Ⅰ. 检测核酸混合物中某种特殊DNA (或RNA )序列的相对含量;Ⅱ. 可对核酸斑点印迹或狭线印迹的相应杂交信号作定量分析;Ⅲ. 可测目的基因在某种特定组织中
或培养细胞中的相对表达强度;⑤应用核酸杂交技术可将极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因“钩”出来。
例如重组体的筛选。DNA 重组后,可以用核酸杂交技术将需要的重组体筛选出来。其方法是:将生长在平碟上的菌落转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用NaOH 处理膜上的菌落,使菌落裂解,使DNA 变性并释放到纤维素膜上。将膜在80℃烘干4—6小时,使DNA 牢固地吸附在膜上。将纤维素膜与放射性同位素标记的探针在封闭的塑料袋内进行杂交。杂交液中一个极重要的因素是盐的浓度。探针可以是一小段与所要筛选的DNA 互补的DNA 或RNA 。杂交一般要维持一个晚上,然后用一定离子强度的溶液将非专一结合的,仅仅是吸附在膜上的放射性物质除去,再烘干纤维素膜,进行放射自显影。从显影后的底片上,可以显示出曝光的黑点,即代表杂交上的菌落。再按底片上菌落的位置找出培养基上相应的菌落,将它扩大培养后,制备出质粒DNA ,作进一步分析。在分子遗传上,也可以利用分子杂交技术将目的DNA 筛选出来。
(6)DNA 重组体的筛选方法(试述三种直接或间接方法,以证明某种外源基因已在转基因生物中存在或表达)
1. 插入失活。由于质粒中含有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因,在这些位点上如插入DNA 片段后,相应的抗菌素基因被破坏,宿主细胞失去相应的抗药性致使其在含有该种抗菌素的培养基上不能生长。这一现象称插入抑制,利用插入抑制,很易将带有外源DNA 的重组体筛选出来。例如,在抗氨苄青霉素位点插入外源DNA 后,宿主细胞因失去对氨苄青霉素的抗性,不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,但仍能在含有四环素的培养基上生长。而不带外源DNA 的野生型质粒的宿主细胞可以在含有两种药物的培养基上生长。这样,利用含有不同抗菌素的培养基可以很容易地将含有重组质粒(即带有外源DNA 的质粒)的细菌筛选出来。
2. 菌落杂交。将生长在平碟上的菌落转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用NaOH 处理膜上的菌落,使菌落裂解,使DNA 变性并释放到纤维素膜上。将膜在80℃烘干4—6小时,使DNA 牢固地吸附在膜上。将纤维素膜与放射性同位素标记的探针在封闭的塑料袋内进行杂交。杂交液中一个极重要的因素是盐的浓度。探针可以是一小段与所要筛选的DNA 互补的DNA 或RNA 。杂交一般要维持一个晚上,然后用一定离子强度的溶液将非专一结合的,仅仅是吸附在膜上的放射性物质除去,再烘干纤维素膜,进行放射自显影。从显影后的底片上,可以显示出曝光的黑点,即代表杂交上的菌落。再按底片上菌落的位置找出培养基上相应的菌落,将它扩大培养后,制备出质粒DNA ,作进一步分析。
3、免疫学方法。如果插入的外源DNA 经表达后产生蛋白质,亦可以用免疫学的方法加以筛选。固体培养基上由菌落所产生的蛋白质,可以转移到硝酸纤维素膜上。然后用相应的放射性标记的抗体进行反应。洗去非特异性吸附的放射性后,用放射自显影显示结果。
(7)阐述电泳法分离同工酶的原理?为什么用聚丙烯酰胺凝胶电泳可得到较好的效果?
1.同工酶指催化相同的化学反应,但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶,分为原级同工酶和次级同工酶。对于同一种酶,其表面电荷是相同的,而对于同工酶,其表面电荷常常不同,在电场作用下,其迁移速率也不同,因此可以用电泳法分离。
2.电泳是指带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象,称为电泳。带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量、颗粒大小和形状有关,同时还受其它外界因素如电场强度、溶液的pH 值、溶液的离子强度、电渗、支持物等等影响。
一般来说,物质所带的净电荷量越多,颗粒越小,形状越接近球形,则在电场中泳动速度越快;反之则慢。由于同工酶彼此之间的理化性质如:所带电荷、形状、分子大小有差异。加之它们是蛋白质,具有许多可解离的酸碱基团,是典型的两性电解质,在一定的pH 条件下,
就会解离而带电,进行电泳时就呈现不同的移动状态,从而将同工酶进行分离,并通过染色等处理就清晰可见,进行鉴别。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE ,也称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳,它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,一般制成凝胶柱或凝胶板,凝胶是由相连的二部分组成(小的部分是浓缩胶,大的部分是分离胶),这二部分凝胶的浓度(孔径大小)、缓冲液组分和离子强度、pH 以及电场强度都是不同的,即不连续的。这样,电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带(厚度约为0.1mm ),然后再进行电泳分离。在圆盘电泳过程中有3种物理效应:①样品的浓度效应;②凝胶对被分离分子的筛选效应(颗粒小的移动快,颗粒大的移动慢);③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好。
(8)试比较分子筛层析、离子交换层析、亲和层析分离蛋白质的基本原理,在分离酶时,你认为选择哪一种层析法最为理想?为什么?(97年博入)
一、分子筛层析:也称分子排阻层析、凝胶过滤法
1.其原理是:当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外;比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离,大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。分子筛是根据分子大小分离蛋白质的最有效的方法之一。
2.常用的凝胶有:琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和葡萄糖凝胶。
3.主要用于蛋白质的分离及相对分子量(Mr )的测定。
分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质,不能用此方法测定分子量。
二、离子交换层析:
1.基本原理:是一种以离子交换树脂作支持剂的层析法,离子交换树脂具有酸性或碱性基团,当溶液中含有酸性(或碱性)的离子时,就可以与离子交换树脂上的碱性(或酸性)基团“结合”而挂在树脂上,例如用带酸性基团的离子交换树脂,在分离时,先处理成钠型,当溶液PH 值为2-3时,蛋白质主要以阳离子形式存在,在洗脱时,由于静电吸引的不同,洗脱顺序大致为酸性蛋白质,中性蛋白质,碱性蛋白质。
2.主要支持的介质有:离子交换纤维素和离子交换交联葡聚糖 ⑴离子交换纤维素 采用纤维素作为交换剂基质。其优点:
①具有松散的亲水性网状结构,有较大的表面积,大分子可以自由通过。因此,对蛋白质来说,它的交换容量比离子交换树脂大;
②交换纤维素的电荷较少,洗脱条件温和,回收率高;
③品种多,可以适用于各种分离目的。
总之,它的出现对酶和其它蛋白质的分离是个重大突破。 ⑵离子交换交联葡聚糖 其基质是用交联葡聚糖取代纤维素
优点:①具有相当多的可电离基团,容量比离子交换纤维素大3~4倍;
②它们既可根据分子的净电荷数量,又能根据分子大小(分子筛效应)进行分离。 3.用于蛋白质、氨基酸、核酸的分离
对氨基酸常用强酸型阳离子交换树脂,流出的顺序大体上是:酸性AA 、中性AA 、最后是碱性AA 。
三、亲和层析:
1.基本原理:是把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到象琼脂凝胶一类的载体表面的功能基上。一般在配基与多糖基质之间插入一段所谓的连接臂或间隔臂,使配基与凝胶间保持足够的距离,不致因载体表面的空间位阻效应妨碍待分离蛋白质
大分子与配基的结合。这类多糖材料在其它性能方面允许蛋白质自由通过。当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时,待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的载体表面而其它蛋白质则不被吸附,它们通过洗脱即可除去,被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。也就是说,亲和层析主要是根据生物分子与特定的固相化配基之间的生物学特异性而使生物分子得到分离。
2.常用分离于酶、抗体、受体、运输蛋白以及完整的细胞器和病毒诱导的肿瘤细胞
在分离酶时,用亲和层析最为理想,因为酶与配体结合具有特异性、亲和性,此法经常只需要一步的处理就可以将蛋白质(酶)从复杂的混合物中分离出来,并且纯度高;酶是具有活性的物质,步骤多会降低酶的活性,因此,用亲和层析分离酶最为理想。
(9) 同工酶的产生及其生物学意义?
同工酶与遗传:同工酶是分子水平的指标,按照一个基因编码一个同工酶的理论,可从同工酶的表现型变异直接推测其基因型的变异,显然优于某些形态学的指标,后者往往是多个基因型的综合表现型;同工酶可用测定酶活力的方法鉴定,较非酶蛋白质分析方便;同工酶比其它指标灵敏,可以反映DNA 上一个碱基的微小变异。
同工酶与个体发育:同工酶和个体发育及组织分化密切相关,在个体发育过程中,从早期胚胎到胎儿组织,再从新生儿到成熟的成年,随着组织的分化和发育,各种同工酶也有一个分化或转变的过程。
同工酶与代谢调节:同工酶的产生可能是基因分化的产物,而基因的分化又可能是生物进化过程中为适应日趋复杂的代谢而引起的一种分子进化,故体内存在同工酶的意义即在于适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要。实验结果表明:同工酶在各组织或亚细胞组分中分布的不同、以及它们之间底物特异性和动力学的差别,决定了同工酶在体内的功能是不同的,同工酶只是做相同的“工作”,不一定有相同的功能。
同工酶与癌基因的表达:研究癌基因的表达,在癌的发病机制及探索癌诊断的指标中具有重要的意义。
(10)肌红蛋白和血红蛋白的结构有何差异?试阐述其结构和功能的相关性
一、肌红蛋白(Mb )的结构与功能 肌红蛋白是肌肉中的储氧物质。它是由一个含153个残基的多肽链和一个血红素辅基组成;肌红蛋白分子呈扁平的棱形,分子中多肽主链由长短不等的8段直的α-螺旋组成,8个螺旋段大体上组装成两层,构成Mb 的单结构域;Mb 的整个分子显得十分致密结实,疏水侧链的AA 几乎全部被埋在分子内部,含亲水基团侧链的AA 残基几乎全部分布在外表面,来与水接触,故肌红蛋白为可溶性蛋白。亚铁血红素辅基位于疏水的空穴内,由原卟啉Ⅸ和一个Fe(Ⅱ) 离子所组成,卟啉环中心的铁原子有六个配位键(其中四个与卟啉分子的N 结合,一个与咪唑环N 结合),一个呈“开放”状态,作为O2的结合部位;血红素与蛋白质结合后,血红素中的Fe(Ⅱ) 能进行可逆的氧合作用。血红素中的铁原子如果处于水环境中,就很容易被氧化成三价,而失去氧合能力。故蛋白质为血红素提供了一个疏水的环境,避免Fe(Ⅱ) 原子发生氧化,以保证血红素的氧合功能。
氧与Mb 结合是可逆的。Mb 的氧结合曲线是双曲线。肌红蛋白的结构特点是和其功能密切相关的,Mb 双曲线型氧和曲线表明:如果肌肉收缩而线粒体中的氧含量下降时,它就立即供氧;肌红蛋白也有利于细胞内的氧从细胞内表面向线粒体转运,因为这种转运是顺浓度梯度的。
二、血红蛋白的结构与功能
①血红蛋白是一种寡聚蛋白,由4个类似于Mb 的亚基(多肽链)组成;②分子呈现球形,四个亚基(两个α链和两个β链)占据相当于四面体的四个角,整个分子呈C2点群对称;③血红素位于分子表面的空穴里,每个亚基都有一个血红素基;4个氧的结合部位保持一定距离,α链(β链)之间相接触,但α链与β链之间很少有相互作用;④在脱氧血红蛋白中,
四个亚基是通过盐桥互相联接的。在两个β亚基之间夹着一分子的DPG 。由于有盐桥的作用,使脱氧血红蛋白分子的构象受到很大的束缚,致使它对氧的亲合力远低于单独的α链、β链或肌红蛋白对氧的亲合力;DPG 分子的插入更固定了其四级结构,进一步降低了对氧的亲合力;⑤当血红蛋白与氧结合时,其四级结构发生剧烈变化,联接亚基的盐桥被打断,DPG 被挤出血红蛋白分子,亚基间的相互位置发生改变,氧分子逐个结合,提高了其余亚基对氧的亲合力,这时脱氧血红蛋白变成氧合血红蛋白,即由T 态(紧张态)转变为(R 松弛)态。T 态是通过几个盐桥稳定的,无氧结合时达到最稳定。氧的结合促进T 态转变为R 态。氧与血红蛋白的结合是别构结合行为的一个典型例证。T 态和R 态之间的构象变化是由亚基—亚基相互作用所介导的,它导致血红蛋白出现别构现象。
Hb 除能进行可逆的氧合作用外,还能运输H+和CO2。由于其是一个四聚体蛋白,具有别构效应,其与氧的结合受到环境中其它分子的调节,如:H+、CO2、DPG 等。
三、Mb 与Hb 结构异同
由上述可知,二者有以下不同之处:
① Mb是单体蛋白,Hb 是寡聚蛋白,有四个亚基; ② Mb只有一个O2的结合位点,而Hb 有4个; ③ Mb分子呈棱形,Hb 分子呈现球形;
相同点:①血红素均位于分子表面的疏水空穴中;
②Hb 的亚基(α链、β链)与Mb 非常相似。
Hb 呈现出3种别构效应。第一,血红蛋白的氧结合曲线是S 形的,这意味着氧的结合是正协同性的。氧与一个血红素结合有助于氧与同一分子中的其他血红素结合。第二,H+和CO2促进O2从血红蛋白中释放,这是生理上的一个重要效应,它提高O2在代谢活跃的组织如肌肉中的释放。相反地,高浓度O2促进H+和CO2在肺泡毛细血管中的释放。H+、CO2和O2的结合之间的别构联系称为Bohr 效应。第三,血红蛋白对O2的亲和力还受2、3-二磷酸甘油酸(DPG )调节,DPG 是一个负电荷密度很高的小分子。DPG 能与去氧血红蛋白结合,但不能与氧合血红蛋白结合。因此,DPG 是降低血红蛋白对氧的亲和力的。氧的S 形曲线结合,波尔效应以及DPG 效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效应。同时由于能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能,因此使机体的氧水平不致有很大的起伏。此外血红蛋白使肌体内的pH 也维持在一个较稳定的水平。血红蛋白的别构效应充分地反映了它的生物学适应性、结构与功能的高度统一性。
(11)什么是抗体?试以IgG 的结构为例分析抗体的主要功能,并简要说明抗体的多样性。 抗原和抗体:当外源物性物质,如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒(细菌、细胞、病毒)进入人或动物体内时,机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白(immune globin),并以之结合,以消除异物的毒害。此反应称为免疫反应,此异物便是抗原,此球蛋白便是抗体。抗体具有两个最显著的特点:一是高度特异性,二是多样性。 IgG 含有两条相同的高分子量的重链(H 链)和两条低分子量的轻链(L 链),四条链通过二硫键共价联接成Y 形结构。IgG 的轻链和重链的一级结构可以划分成若干结构域,这些结构域根据它们的顺序同源进行分类。每种免疫球蛋白的轻链都含有可变区和恒定区;同样,重链也含有可变区和恒定区。在可变区内还存在高可变区,H 链和L 链的高可变区一起提供氨基酸残基以形成抗原-抗体结合部位,每种抗体的特异性决定H 链和L 链高可变区内氨基酸序列。重链的CH1和CH2区通过一个铰链区连接,用木瓜蛋白酶处理时,在铰链区可发生断裂,生成Fab 片段。Fab 片段仍能与抗原结合表明轻链是抗原结合的部位。免疫球蛋白三级结构的最主要特点是所谓免疫球蛋白折叠,它是由二个β-折叠片夹着疏水残基内核而形成的一种结构式样。
(12)画出肌红蛋白(Mb )和血蛋红(H b)的氧合曲线,并讨论各自氧合曲线与其功能的相关性。
从图中可以看出:Mb 随着氧分压的升高,氧饱和百分数迅速增加,如果肌肉收缩而线粒体中的氧含量下降时,它就立即供氧;肌红蛋白也有利于细胞内的氧从细胞内表面向线粒体转运,因为这种转运是顺浓度梯度的。血红蛋白氧的S 形曲线表明,血红蛋白能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能,因此使肌体的氧水平不致有很大的起伏。此外血红蛋白使肌体内的pH 也维持在一个较稳定的水平。血红蛋白的别构效应充分地反映了它的生物学适应性、结构与功能的高度统一性。
(13)为什么测定酶活力时一定要测定初速度,且一般以测定产物增加量为宜? 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力;酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示,两者呈线性关系。酶催化的反应速率愈大,酶的活力愈高;反应速率愈小,酶的活力就愈低。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速率。酶催化的反应速率用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。在酶活力测定实验中底物往往是过量的,因此底物的减少量只占总量的极小部分,测定时不易准确;产物却是从无到有,只要测定方法足够灵敏,就可以准确测定。并且在酶促反应中,底物减少与产物增加的速率相等,因此,在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为宜。
以产物生成量(或底物减少量)对反应时间作图,曲线的斜率表示单位时间内产物生成量(或底物减少量)的变化,所以曲线上任何一点的斜率就是该点相应时间的反应速率。曲线在反应开始的一段时间内斜率几乎不变,但随着时间的延长,曲线逐渐变平坦,斜率发生改变,反应速率降低,显然这时测得的反应速率不能代表真实的酶活力。引起酶促反应速率随时间延长而降低的原因很多,如底物浓度的降低;产物浓度增加加速了逆反应的进行;产物对酶的抑制或激活作用以及随着时间的延长引起酶本身部分分子失活等。因此,测定酶活力时一定要测定初速度。
(14)真核生物转录后、翻译后均存在复杂的信息加工,试分析其生物学意义?
真核生物的rRNA 和tRNA 的前体加工过程和原核生物有些相似,但mRNA 前体加工过程比较复杂。真核生物大多数基因含有居间序列,需要在转录后的加工过程中予以切除。大多数真核基因都是断裂基因,断裂基因的转录产物需要拼接,去除插入部分(内含子),使编码区(外显子)成为连续序列,这是基因表达调控的一个重要环节。内含子具有多种多样的结构,拼接机制也是多种多样的。有些内含子可以催化自身拼接,有些内含子需在拼接体作用下才能拼接。RNA 编码序列的改变称为编辑。RNA 编码和读码方式的改变称为再编码。由于存在选择性拼接、编辑和再编码,一个基因可以产生多种蛋白质。
核糖体上新合成的多肽被送往细胞的各个部分,以行使各自的生物功能,也可分泌到胞外。真核细胞中新合成的多肽被送往溶酶体、线粒体、叶绿体胞核等细胞器。所以新合成的多肽的输送是有目的、定向地进行的。尽管蛋白质生物合成中遗传密码只指导20种氨基酸的掺入,然而,对于成熟蛋白质的分析表明,可发现上百种氨基酸的存在,但它们也只是在
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种氨基酸基础上衍生出来的。这种翻译后加过程使得蛋白质组成更加多样化,从而导致蛋白质结构上呈现更大的复杂化。除了对氨基酸残基的侧链基团进行修饰外,还有合成出的部分肽段在蛋白质成熟过程中被切除。这些修饰和加工过程是与这些蛋白质是在什么部位合成的,要运送到什么部位去有关。
(15)试设计一个实验证明真核细胞蛋白质合成是在内质网上进行的。
将放射性同位素标记的氨基酸注射到小鼠体内,经短时间后,取出肝脏,制成匀浆,离心,分成核、线粒体、微粒体及上清等组分。发现微粒体中的放射性强度最高。再用去污剂,如脱氧胆酸,处理微粒体,将核糖体从内质网中分离出来,发现核糖体的放射强度比微粒体的要高7倍。这就说明核糖体是合成蛋白质的部位。
(16)为什么说蛋白质的一级结构决定其高级结构并决定其特定的生物学功能(研究蛋白质一级结构有何意义)?
蛋白质的一级结构指蛋白质肽链中的氨基酸序列;二级结构指在一级结构上形成的α-螺旋、β-折叠、无规卷曲以及超二级结构;三级结构指对较大的蛋白质分子或亚基,多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体(结构域)缔合而成的;四级结构指球状蛋白质通过非共价键彼此缔合在一起的聚集体。一条多肽链是否形成α-螺旋、β-折叠等二级结构形式,与它的氨基酸组成和排列序列密切相关的,R 基的大小、R 基的类型、氨基酸的电荷等都影响多肽链折叠。三级结构决定于氨基酸的序列最有力的证据来自某些蛋白质的可逆变性实验。特别是六十年代进行的牛胰核糖核酸酶(RNase )复性的经典实验。当天然的RNase 在8mol /L 尿素存在下用β-巯基乙醇处理后,分子内的四个二硫键即被破裂,整个肽链伸展而成无规卷曲,同时酶活性完全丧失。但是当用透析方法将尿素和巯基乙醇除去后,RNase 活性又可逐渐恢复,最后达到原来活性的的95%-100%。在恢复过程中形成若干二硫键随机分布的无活性中间体,此时如若加入极微量的巯基乙醇可以催化二硫键的重排,加速RNase 完全复性。经多方面的分析表明复性后的产物与天然的RNase 并无区别,所有正确配对的二硫键都获得重建。
镰刀状贫血病是由于由于遗传基因突变导致血红蛋白分子中氨基酸残基被更换所造成的。病态血红蛋白S 与正常血红蛋白所不同的只有β链N 未端开始的第六位的氨基酸残基,在正常的HbA 分子中是谷氨酸,病态HbS 分子中为缬氨酸所代替。Glu 的侧链是一个带电基团,而V al 是一个非极性基团。从三级结构看,由于β6位于分子表面,因此Glu 被换成Val ,等于在HbS 表面安上一个非极性侧链。从四级结构是看氧合HbS 和HbA 没有多大区别。然而在低氧浓度(脱氧)时,HbS 的溶解度剧烈下降(仅为脱氧HbA 的1/25),HbS 分子发生线性缔合,形成长链,由多条长链进一步聚集成多股螺旋的微管纤维束。这就是导致红细胞溶血的原因。
因此,三级结构归根结底是由一级结构决定的。同样,由于蛋白质的四级结构是在三级结构上形成的,因此其构象归根结底也是由一级结构决定的。综上所述,蛋白质的一级结构决定其高级结构并决定其特定的生物学功能。
(17)举例说明别构酶结构的特点及其在代谢调节中的意义(97年博入)
别构酶:酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象地改变,进而改变酶活性状态,称为酶的别构调节。具有这种调节作用的酶称为别构酶。
结构特点:
①一般都是寡聚酶,在别构酶分子上有和底物结合和催化底物的活性部分,也有和调节物或效应物结合的调节部分,这两种部位可能在同一亚基上,也可能分别位于不同的亚基上; ②别构酶有协同效应,分正协同效应和负协同效应两种,
正协同效应Rs <81,Rs 愈小,正协同效应愈显著;负协同效应Rs >81,Rs 愈大,负协同效应愈显著;Rs=81为典型的米氏类型酶;
③ 经热或化学试剂处理,可引起别构酶解离,失去调节活性。 浓度或配基饱和度时的底物 结合达或配基酶与底物浓度或配基饱和度时的底物结合达或配基酶与底物
举例: 3-磷酸甘油醛脱氢酶是具有负协同效应的别构酶,它是糖分解途径中的重要酶,与供能有关。此酶具有4个亚基,可以和4个NAD+结合,但结合常数不同。酶结合NAD+后,发生构象变化。NAD+和酶结合的解离常数很小,因此虽然底物NAD+浓度很低,也能顺利地和酶结合,但是当NAD+浓度升高时,酶结合了两个NAD+后,再要结合第三、第四个NAD+就不那么容易。除非NAD+的浓度提高两个数量级,才会有进一步的结合。也就是说这时再要提高酶反应速率是较难的,需要底物浓度大大提高才行。实验结果发现,3-磷酸甘油醛脱氢酶只能结合两分子NAD+,即此酶结合NAD+的位点,只有一半能与NAD+起反应,叫半位反应性。半位反应性是一种极端负协同效应。说明在一定的底物浓度范围内,底物浓度的变化不足以影响酶反应速率,这即是负协同别构酶的特点。在有机体中有许多需要NAD+的代谢途径,其中酵解过程特别重要,在供氧不足的情况下,它们以一定的速率稳定地进行反应。因为3-磷酸甘油醛脱氢酶为此过程的负协同别构酶,对底物NAD+浓度的变化不敏感,所以,当NAD+浓度很低时,其他需要NAD+的代谢反应都随之减缓时,酵解过程仍然能以一定的速率顺利地进行。由此可以看到负协同效应别构酶的重要生理意义。
(18)大分子物质(如蛋白质、核酸、酶)分离纯化方案设计的基本原则,基本路线是什么?在执行具体方案时是应收集哪些数据才能对方案的合理性进行评价,举例说明
大分子物质(如蛋白质、核酸、酶)分离纯化方案设计的基本原则是在分离纯化过程中即要得到高纯度的产品,又要使大分子物质活性损失最小。基本路线是前处理,粗分级分离,细分级分离。在执行具体方案时应收集电泳酶谱分析、分子量测定、选择性抑制和激活实验、亚基分离、末端分析、一级结构分析和动力学分析等相关数据才能对方案的合理性进行评价。 例如对同工酶类型的生化鉴定,其分析步骤为:
(19)tRNA 在蛋白质合成中的作用来讨论其结构与功能的统一性。
tRNA 是核酸的一种,约点全部RNA 的15%。其一级结构为3’-5’走向的四种核糖核苷酸组成,3’未端为,CCA-OH, ;二级结构呈三草叶形,由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和T ψC 环组成;三级结构为倒L 形。TRNA 的生理作用不仅是转运氨基酸,它在蛋白质生物合成的起始作用中,在DNA 反转录合成中及其他代谢调节中也起着重要作用。tRNA 的结构决定了其主要功能:1. 在蛋白质的合成中转运氨基酸,氨基酸臂结合氨基酸,而且氨基酸臂的3’未端只能接受活化的氨基酸;2. 反密码环有一个反密码子,与模板mRNA 配对;3. 氨酰tRNA 合成酶被认为是结合在倒L 形侧背上;4. 还具有核糖体识别位点。
(20)分离纯化酶时应收集那些数据才能对方法的合理性进行评价?试举例说明。
酶有胞内酶和胞外酶之分,胞外酶容易收集分离,提取胞内酶比较难些,一般要经过以下步骤: 1.破碎细胞:根据所用的试验材料种类(动物、植物或微生物)和数量,可分别使用研钵、组织匀浆器、细菌磨、组织捣碎机、超声波、溶菌酶或化学试剂,进行冻融或自溶处理,使细胞破裂,将酶释放出来; 2.抽提: 用水或缓冲液将释放出来的酶溶出来,然后离心去掉各种细胞碎片,这样得到的酶是粗提液,会有各种杂质,如蛋白质、核酸、多糖等;
3.分离提纯 由于酶是蛋白质,可用分离提纯蛋白质的方法进行,常用的方法如下:
①盐析 利用酶蛋白在不同浓度的盐溶液中的溶解度不同,将酶进行分步沉淀,以达到分离的目的。常用的盐有硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等。盐析法设备简单,容易操作,是广泛应用的一种方法。
②有机溶剂沉淀 用能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等,在不同浓度下沉淀酶。此法分辨效率高,提纯效果好,但高浓度的有机溶剂常引起酶活力的丧失。
③吸附法 用吸附剂如淀粉、氧化铝、硅藻土、磷酸钙等在弱酸性或中性条件下,选择性地吸附酶,然后过滤、分离,再用较高pH 值的高浓度盐溶液把酶从吸附剂上洗脱下来,而得纯酶。
④其它方法 还有凝胶过滤法、超离心、离子交换法、亲和层析法、凝胶电泳法,都可以得到纯酶。 为了保持酶活力不受损失,一切操作都始终应保持在0-5℃的低温下,用有机溶剂分离时,温度更低(-15—-20℃)。为防止重金属离子使酶失活,还需要向抽提液中加入少量EDTA ,另外要加入少量的巯基乙醇,以防酶分子的-SH 基被氧化。
分离提纯的酶容易失活,如需要长期保存,可用冰冻干燥法除去水分,制成干粉,在0-5℃下保存。 应收集的数据:除温度、PH 、离子强度、时间等外,还应有:
1.每一步分离提纯步骤后,都应量提取液的总体积,并留出适量经透析后测定蛋白质含量和酶活力。 2.总蛋白质:双缩脲法或Folin 酚法,总蛋白氮,3. 比活力、总活力、纯化倍数 4.利用亲和层析纯化酶时,还要收集:偶联率(间接法)、配基偶联量、配基含量。
21)什么叫受体? 有何特征和类别? 简述一种分离提纯的方法原理。
受体:是细胞表面或在细胞组分中的一种天然分子,可以识别并特异地与有生物活性的化学信号分子(配体)结合,从而激活或启动一系列生物化学反应,最后导致该信号物质特定的生物效应。受体的特点:受体与配体结合具有特异性、亲和性、饱和性。受体的类别:胞内受体、胞外受体。
亲和技术提纯受体:在含有配体的洗脱柱中,用去垢剂溶解膜蛋白 加洗脱液,从柱中洗去结合的蛋白,去掉非特异性蛋白 加过量的配体,将受体从固定化的配体上洗下来 洗脱下来的是受体-配体复合物
1.蛋白质一级结构测定的战略原则是将大化小,逐段分析,片段重迭,确定全序。
⑴用二种以上的水解法,将待测序的肽链水解成一系列大小不等的肽段; ⑵分离纯化肽段,分别测序
⑶小肽重叠排出氨基酸的排列顺序
2.DNA 序列测定的战略原则是用一种ddNTP (双脱氧核苷酸)终止DNA 链的延长,各种不同长度的DNA 链就可被合成出来,并且它们的分子未端都被ddNTP 终止。
⑴用相同的4组引物—模板混合物,每一组加4种dNTP (其中一种用放射性同位素标记),各组反应中还加入一种2’,3’ddNTP 。
⑵每组将产生以一种特异性ddNTP 为未端的不同长度的核苷酸链
⑶通过PAGE 电泳,能够将相差一个核苷酸的DNA 片段分开,放射自显影后,根据长短排列,根据特定末端碱基的DNA 片段就可读出待测DNA 的碱基序列。
1. 两者不同之处:前者是“将大化小,分段测序、肽段重叠、测定全序”;后者是“合成长度
不同的DNA 链,PAGE 分离,放射自显影,直接读序”
1、什么是第二信使?举两个例子说明第二信使的作用?
2、现在发现了很多生长因子,如表皮生长因子,神经生长因子等,请阐述一下他们的共同点
3、画图说明大肠杆菌乳糖操纵子的调控方法
4、简述真核生物的基因特点:比较真核与原核基因转录的差异
5、说明血糖的来路和去路。