生态毒理学1(6)
第—节 环境污染物的生物标志物
一、概述
污染物进入生物机体后,经过生物体内的代谢,一些污染物被代谢成无毒的物质排出体外,另一些污染物或一些污染物的代谢产物产生对生物不利的影响。
污染物对生物机体的最早作用是从生物大分子开始的,然后逐步在细胞、器官、个体、种群、群落、生态系统各个水平上反映出来。
污染物进入机体后,首先将导致机体一系列的生物化学变化。这些变化广义上说可分为两种: 一种是用来保护生物体抵抗污染物的伤害,称之为防护性生化反应;
另一种不起这种作用,称之为非防护性生化反应。
防护性生化反应的机理是通过降低细胞中游离污染物的浓度,从而防止或限制细胞组成部分发生可能的有害反应,消除对机体的影响。
要确定某种污染物对环境造成的危害程度,就需要检测并衡量其引起的生物效应。这对污染物质的鉴定和来源分析十分有用。
生物监测就是根据化学物质能够引起生物效应的原理进行的。特定的生物效应可以表征某特定化合物及其有害暴露效应。
作为生物标志物,生化水平的生物效应有着很明显的优势。
生化系统或分子水平的变化往往是环境变化引起的生物效应中能最先被定量检测出来的; 生化系统的变化既可以做化学暴露的标志,又可以做其产生的有害影响的标志。 目前对环境污染物产生效应的主要系统有:
1)细胞色素P450单加氧酶是一种蛋白质,与有机化合物在体内的生物转化有关,导致分子变化和有毒代谢物的活化或是钝化。
2)金属硫蛋白是种低相对分子质量能与金属结合的蛋白质,与重金属的螯合及代谢有关。在实验室或是野外的条件下,其合成可以由各种营养必需和非必需的有毒重金属所诱导。
3)应激蛋白或热冲击蛋白是一组可以用不同物理条件和化学制剂诱导合成的蛋白质。其中的一些被认为在保护细胞使其免受环境干扰中起着重要作用。另一些与各种基因的调节有关。
4)相II(结合)酶通过使外源化合物(包括细胞色素P450激活的代谢物)与水溶性的内源化合物结合,在外源化合物的解毒和排泄中起辅助作用。
5)氧化剂媒介效应促进细胞中游离氧的产生。游离氧含量的增加会诱导一些抗氧化酶的产生,改变其他抗氧化物质的浓度,而且产生与氧化伤害相关的生化损伤。
6)亚铁血红素和卟啉的合成对生命活动至关重要。尽管对于非哺乳动物生物种体内的这种酶促反应所知甚少,大量有关哺乳动物的文献著作都记录了其对有机和无机化学物质的敏感性。这种酶促反应的混乱与明显的细胞损伤有直接关联。
二、细胞色素P450
细胞色素P450指的是转化有机化学物质结构的一系列酶。原核生物和真核生物中超过100个P450基因已经被测序,由这些酶催化的反应一般被统称为混合功能氧化酶反应或是单加氧化酶反应。
有机化学物质的毒性可以通过结构转化而大大改变。
当机体暴露于许多种的化学物质时,某些类型的P450的数量会减少(或增加),导致由这些酶催化的物质转化反应速率改变。
P450的诱导能对有机体承载的毒物含量或是有机体对环境中化学诱导物暴露程度起到灵敏的指示作用。
细胞色素P450酶对内源的和外源的化合物均能转化。在动物体内P450合成并降解类固醇、前列腺素、脂肪酸和其他生物分子。
在转化外源化合物时,P450在污染化学物质、药物以及其他化学致癌物质的毒理作用和排
泄过程中均起了关键的作用。
P450的催化功能和调节作用能界定动物的不同细胞、器官、个体以及种群对外源化合物(特别是那些毒性决定于生物转化的化合物)的敏感性大小,对P450调节机理的详细掌握对于了解不同化学物质的毒性以及P450生物标示方面的应用来讲十分关键。
三、金属硫蛋白
金属硫蛋白指的是一些低分子量、富含半肮氨酸,能够结合金属的蛋白或多肽。其中的Cys残基可以作为配体与金属发生螯合作用。
在各种生物中都能够发现金属硫蛋白。镉、铜、锌、汞、鈷、镍、银等重金属部能够诱导金属硫蛋白的合成。
由于已经有一些科学基础和测定金属硫蛋白的合成与金属化合物的方法,金属硫蛋白可以作为指示过度暴露于有毒金属的生物标志物
四、应激蛋白质
应激蛋白质作为生物标志物,主要是热冲击蛋白质和葡萄糖调节蛋白。
应激蛋白质可以作为环境污染生物标志物的理想候选指标,其原因有三:
1它们是细胞自我保护反应的一部分;
2它们被多种多样的环境压力因子所诱导;
3是从微生物到人的所有生物中的高度保守性。
五、第二阶段酶
外来化合物的生物转化常常是有顺序的反应。
第一步(阶段I)通常是一个氧化过程,引入了一个如羟基基团的极性部分。该反应通常被细胞色素P450单加氧酶系统催化。
其后的反应包括一个第二类酶催化反应,称其为第二阶段反应或连接反应。第二阶段酶(又称结合酶)将代谢产物与细胞中多种高浓度水溶性内生化合物连接。
研究最广而且最重要的第二阶段酶是谷胱甘肽转移酶,UDP—葡萄糖醛酸基转移酶和硫转移酶,这些是分别与谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、硫酸盐连接的代谢产物。
在一些情况下,由于第二阶段酶暴露于多种外源化合物的影响,很有兴趣将它们应用于污染暴露或影响及效应的指示物或生物标志。
这部分主要介绍连接酶的功能、产生、性质,并重点描述外源化合物对这些酶活性的影响方面。
(一)谷胱甘肽转移酶
谷胱甘肽转移酶(GST)是一种重要的酶系,它因能催化多种亲电子化合物与谷胱甘肽的结合而得名。它同时还能参与解毒作用。
谷胱甘肽转移酶在目前研究的所有动物物种都存在,相当大的物种差异性表现为对各种底物的活性不同。
已经从许多种类的哺乳动物、鱼类、无脊椎动物中提纯出了GSTs。
在鼠类中,GST同工酶的多样性来源于至少六个亚基的二聚化合物。
由多种典型的药物代谢诱导剂诱导的GST效应已经在哺乳动物中得以描述。
涉及GST各种水生生物活性的可诱导性研究已研究过多环芳烃 PAH-类型诱导剂,至今研究结果并不一致。在淡水攀鲈肝脏内GST活性由于包括苯的多种有毒物质作用而增长了超过2倍。用多氯联苯 (PCB)处理的海峡鲶鱼的肝GST活性有轻微增长,而红鲈的GST表现出不受PCB或多溴联苯 (PBB)处理影响。
(二)环氧化物水解酶
在细胞中,环氧化物水解酶(EH)与GST争夺由单加氧酶系统产生的环氧化物底物。将一个水分子加入一个环氧化物基团导致一个二醇的形成。
EH存在于至今所研究的所有动物种中,脊椎动物的肝脏和无脊椎动物的肝胰腺显著富含EH,尽管该酶在肝外器官中同样存在。
在哺乳动物和水生生物物种间表现出物种和性别的差异,在同一物种不同个体间也存在高度多样性。
哺乳动物微粒体EH可被铅和间位1,2-二苯乙烯氧化物诱导,尚未有水生生物种EH活性化学诱导的证据。
(三)UDP-葡萄糖醛酸基转移酶
UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UDPGT)催化从5`-二磷酸葡萄糖醛酸到一些包括羟基化PAH和多种内源化合物在内的受体葡萄糖醛酸基团。通常用于测定UDPGT活性的底部包括磷酸硝基酚、睾丸激素。
UDPGT活性在肝脏以及肝外组织中都存在。据报道鱼类UDPGT活性受性别、季节、pH值,温度差异的影响。
暴露于环境毒物可引起水生物种的UDPGT活性的诱导。产生效果的化合物通常属于PAH型诱导剂种类。
尽管UDPGT的诱导通常导致诱导剂和相关化合物的解毒作用,同样会出现一些不良反应。 在一些研究中暴露于PAH型诱导剂引起UDPGT活性提高的同时,已发现其他环境污染物对于UDPGT活性具有抑制效应。例如,用三氯苯酚、五氯苯酚、脱水松香酸处理彩虹鲑色,肝UDPGT活性降低高达85%。
(四)硫转移酶
硫转移酶(ST)是催化3`-磷腺苷5`-磷酸硫酸基中磺酰转化为诸如乙醇、苯酚、胺等亲核试剂的胞质酶。
许多从哺乳动物组织分离的ST组分对于异型生物质有活性。
然而尚无关于哺乳动物硫转移酶能够被异型生物质诱导的证据。
水生生物中ST存在的证据已得到充分论述,然而仍没有关于这些物种中被诱导的证据。
(二)抗氧化剂
1.超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶(SOD)是一组金属酶。
由于金属中心的不同.可以将SOD分为三种类型:
铜锌SOD:典型的与真核细胞胞液及高等植物叶绿体相联系。
锰SOD:在细菌及高等生物某些细胞器(如线粒体和叶绿体)中发现。
铁SOD:在细菌和少数高等植物中发现。
SOD被认为发挥关键性的抗氧化物作用,它们的重要性在其存在于所有已研究的好氧生物体中均有作用。此外,该酶是所描述的酶中活性最高的一种。
SOD是高度诱导性酶,这是作为生物标志物的基础。当暴露于强氧化剂污染时,生物体组织的SOD活性增加有许多例子:如暴露于百草枯的鼠类肝组织,有肋蚌类;暴露于SO2的白杨树叶等。
SOD在生物标志物方面的用途有待深入观察和研究,如不同同工酶(诱导)的效应研究,特别是与特殊细胞器相联系的同工酶。包括野外研究在内的这种研究为在现场监测暴露生物亚细胞水平氧化效应提供了一条有效途径。
2.过氧化氢酶
过氧化氢酶(CAT)是血色素存在酶,能通过如下反应催化H202的转化:
CAT仅能分解H202。CAT活性大小与过氧化物体或微粒体有关。
在暴露于百草枯的鼠类及有肋蚌类中已观察到CAT活性增加。此外,在暴露于两种复杂混
合物的鲶鱼中观察到显著的增长(增1.5-2.5倍)。
3.过氧化物酶
过氧化物酶系包含了许多酶,这些酶将各种过氧化物还原成相应的醇类。
在动物体中,硒依赖性四胺细胞质酶将谷胱苷肽作为辅助因子;反应由谷胱苷肽过氧化物酶(GPx)催化,反应式如下
在植物体中,依赖抗坏血酸盐的过氧化物酶(AsPx)充当着关键的抗氧化作用,主要是清除叶绿体内的H202。
过氧化物酶(Rx)(尤其是AsPx)有可能是目前最可行的关于气态氧化污染物标志物。
GPx作为动物体内生物标志物的研究,末受到重视,有关信息表明动物体中的GPx对氧化强化剂的反应不如植物AsPx灵敏。
4.谷胱甘肽还原酶
在面临氧化压力时谷胱甘肽还原酶(GR)能维持GSH/GSSG比例。另外,这种酶活性的改变在诠释GSH/GSSG数据时非常重要,这将提供一种非常有用的生物标志物。
在暴露于O3的小鼠、豌豆和菠菜等体内发现GR标志物增加。
5.谷胱甘肽(GSH)
谷胱甘肽是一种三肽化合物,包含谷氨酸,半胱氨酸和甘氨酸,由于GSH的生物合成,调节以及其各种胞内功能,因此其减少已受到重视。
已有研究表明,污染物诱导GSH合成的增强,例如,暴露于镉和石油油下的条纹鳕鱼以及几种暴露于SO2的植物。
GSH在解毒作用和对外源性化合物响应中的关键性作用仍在研究中。
6.抗坏血酸盐(维生素C)
抗坏血酸盐是一种重要的水溶性的抗氧化剂,另外还可作为脯氨酸羧化酶和赖氨酸羧化酶的辅助因子。植物和许多动物都能合成抗坏血酸盐,但有一些动物(包括人类)缺乏这种合成酶。需要在饮食中补充。
抗坏血酸盐作为生物标志物的运用仅限于能合成它的动植物中。
针叶树暴露在气态氧化学污染物时,体内抗坏血酸盐浓度增加;生活在白牛皮纸厂的排污水体中的鲈鱼体内的抗坏血酸盐浓度要高于生活在对照区的鱼。
7.α-生育酚 (维生素E)
维生紊E是植物合成的脂溶性抗氧化剂,但也是动物所需。这种化合物能保护膜,防止脂质过氧化。
气态污染物暴露下的针叶树、其体内维生素E浓度增加。它的直接作为标志物的应用目前仅限于植物体。
(三)氧伤害生化指标
不断增加的氧自由基会引起生化和生理效应。从生物标志物角度来看.生化干扰包括脂质过氧化、DNA氧化反应,高铁血红蛋白和氧化还原状态。
1.脂质过氧化
多不饱和脂肪酸氧化状态是氧化压力的非常严重的后果,已经被广泛研究,脂质过氧化过程表明一个单独的自由基就可产生一系列有害的生化反应。
当生物体内暴露于各种化合物时,都可能引起脂质过氧化,例如,除草剂暴露下的鲤鱼,暴露于对乙酰氨基酚的鳕鱼,O3暴露下的松树,脂质过氧化很有可能作为生物标志物。
2.DNA氧化
最近,已有关于氧自由基引起的DNA修饰的测定方法。 · OH攻击DNA链的不同位置而产生羧基化合物。最可行的测定这些产物的方法运用HPLC分离和电化学方法测定羧基化产物。
这些方法非常敏感,但较复杂。将这些方法进一步改进就可能增加它作为生物标志物的可行性。
3.高铁血红蛋白
在正常条件,脊椎动物体的红细胞一小部分(不到1%-2%)以高铁血红蛋白(MetHb)形式存在。
不断增加的MetHb 浓度为红细胞内的氧化损伤提供了敏感的指标。
已经表明有几种化合物能增强MetHb的形成,包括大量芳香族联氨化合物、喹啉、硝酸和一些过渡金属尤其是铜。另外,瑞典野外研究造纸废水时,发现生活在造纸厂污水中的鲈鱼体内MetHb 浓度要高于生活在对照区内的。
4.氧化还原状态
由氧自由基产生的化合物的更多的效应是表现在组织和细胞的氧化还原状态。NADH和NADPH,GSH。
产生氧自由基的化合物是对细胞内还原剂强加了一种额外的消耗。
关于氧化强化剂对氧化还原状态的影响研究不多。我们先前讨论了氧化刘对GSH/GSSG比值的影响。有研究认为除草剂主要作用于NADPH。
八、污染对酶的抑制作用
一些环境污染物可抑制酶的活性。酶活性的抑制可分为不可逆性抑制、非竞争性抑制和竞争性抑制:
不可逆性抑制是由于污染物与酶蛋白的活性中心功能基团不可逆性结合而引起的;
非竞争性抑制是指污染物与酶分子的结合位置不在底物的结合位置,因此增加底物浓度,不能使抑制作用逆转;
竞争性抑制的特点是,当底物浓度增加时,抑制作用减弱。竞争性抑制作用的强弱取决于抑制剂的浓度与底物浓度的相对比例。
有些污染物是通过生成中间代谢产物抑制酶活性,造成生物化学损害。
(一)腺苷三磷酸酶
腺苷三磷酸酶(ATPase)是生物体重要酶,存在于所有的细胞中,在细胞供能活动、离子平衡等过程中起重要作用。早在研究有机氯农药如DDT的作用机制时,就发现DDT对Na+ /K+ATPase,Mg-ATPase有抑制作用。
至今已发现多种水生生物、鸟类、哺乳类等的多种组织,如脑、鳃、肾和肌肉中多种ATPase对不同污染物均有反应,如有机氯农药、增塑剂、多氯联苯、金属、炼油废水等。 经过近30年的研究ATPase抑制已作为一项评价污染压力的指标。
(二)乙酰胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶(AchE)在神经系统的信息传导中起重要的作用。早在20世纪50年代,人们就发现有机磷农药和氨基甲酸酯农药对高等和低等动物的AchE具有明显的抑制作用,从而产生对生物的神经功能破坏,导致一系列生物学效应。
对于野生脊椎动物研究的器官通常是大脑,研究发现AchE抑制具有较高的专一性和敏感性,用其作为指标可以表明生物受到有机磷农药和氨基甲酸酯农药的暴露。
一般认为,20%以上AChE抑制证明暴露作用存在,50%以上的AchE抑制表明对生物的生存有危害。
(三) △-氨基乙酰丙酸脱氢酶
△-氨基乙酰丙酸脱氢酶(ALAD)存在于许多组织的细胞质中,在合成血红蛋白中起重要作用。铅(Pb)能直接抑制鱼类、鸟类和哺乳类ALAD活性。血液中铅浓度与ALAD活性抑制具有典型的剂量-效应关系。
由于ALAD测定方法简单和精确,目前把ALAD作为一个敏感的指标,应用于监测和评价
铅污染对生态系统的影响。
(四)蛋白磷酸酶
蛋白磷酸酶(PP)广泛存在于细胞中,对任何一种蛋白质进行脱磷酸化作用。
微囊藻毒素是迄今最强的蛋白磷酸酶抑制剂。微囊藻毒素是蓝藻的次生代谢产物,是水体富营养化危害之一。
由于微囊毒素毒性大,易在软体动物、甲壳类等水生生物体内积累,而且可通过食物链迁移和生物放大、因此,微囊藻毒素的危害受到了广泛重视。
用蛋白磷酸酶活性可检测微囊藻毒素的含量,而且方法具有很高的灵敏性。
九、脱氧核糖核酸(DNA)变化
脱氧核糖核酸是生物体内重要的大分子,DNA可以受到不同途径的损伤,如正常细胞活动过程中的损伤;紫外线和放射性物质的直接损伤;外源性化合物及其活性代谢产物与DNA结合等。
DNA发生损伤的生物学后果是严重的,但细胞本身具有修复能力,一旦损伤发生,修复能力迅速被诱导,各种修复酶增加并被活化。
如果损伤的DNA不能被修复,则产生DNA结构和功能影响,导致细胞死亡或细胞突变,产生遗传疾病。
外源性化合物及其活性代谢产物与DNA相互作用形成DNA加合物是产生DNA损伤最早期的作用,随后产生的最重要的影响是DNA结构改变,包括碱基置换,碱基丢失、链断裂等。化合物与DNA最常见的结合是共价结合。
许多研究发现,污染严重的水体沉积物导致底栖鱼类中DNA加合物形成,并表明DNA加合物形成与鱼类肿瘤形成有很好的相关性。
受损的DNA可以被机体自身修复,许多因素能影响DNA修复能力。目前也巳发现一些污染化合物能影响机体的修复功能,例如,对修复过程酶活性的抑制。
(四)生物标志物的特征
第一,以上所述的每一个系统都是多组分系统,所列举的反应是该特征只适应这些组分中的有限的一部分。例如,细胞色素P450,只提及细胞色素P4501A蛋白;其他可以作为生物标志物的P450蛋白可能具有不同的性质。
第二,这些系统中对污染的反应绝大部分基于从传统哺乳类获得的知识,或者虽然是其他物种但是未涉及环境问题。
这两点强调了对所有体系上继续进行基础研究的必要性和价值。
第三,利用蛋白质作为生物标志物,方法学很重要,对由于化学暴露而出现的变化的解释也很重要。这些考虑包括对分析方法和可靠性的实际应用。
样品处理:所有已经讨论的分析所获得的结果的可靠性将受所采集的动物的条件、生物组织处理方法及样品前处理等因素的影响。
环境和生物变量:众所周知环境和生物的可变性影响了这些系统的水平和作用,也影响了这些系统对化合物的反应。环境变量包括温度、含氧量、含盐量;生物变量包括激素情况,尤其是涉及性和繁殖。