串联亲和纯化的应用及发展[1]

●　技术与方法

《生命的化学》２００９年２９卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００９，２９（４）

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文章编号：　　１０００－１３３６（２００９）04－0581-07

串联亲和纯化的应用及发展

闫昭骐　窦岩梅　杜宏武

（北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系，北京　１０００８３）

摘要：串联亲和纯化（ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　ＴＡＰ）最早作为一种研究酵母细胞内天然状态下蛋白质相互作用的工具，目前不仅在多个技术领域已成为筛选鉴定新蛋白质复合体的重要工具，并且将成为系统生物学研究的一项关键技术，在探索和绘制生理条件下多细胞生物蛋白质相互作用网络图谱中发挥主导作用。本文就ＴＡＰ近些年来的研究进展进行了概括，并对其常见问题与改进策略进行了总结。ＴＡＰ技术的不断完善，必将使其在蛋白质相互作用领域发挥更重要的作用。

关键词：串联亲和纯化；蛋白质复合体；标签中图分类号：Ｑ８１

串联亲和纯化（ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　ＴＡＰ）［１］

是近几年来发展迅速的一项新兴生物技术，它以其高效、高纯度、以及能够高度模拟真实生理条件等优势，迅速成为筛选、发现和鉴别新的相互作用蛋白质的主流技术之一。该技术利用亲和层析的原理，对目标蛋白质进行两歩纯化。目标蛋白质基因与ＴＡＰ标签融合后，被导入体内进行表达。一般情况下，这些带标签的蛋白质在体内进行正常的生理活动并与其他蛋白质相互结合。利用ＴＡＰ标签对蛋白质进行两次亲和纯化后，就得到了相对纯净的、生理条件下存在的蛋白质复合体。近几年，这项最初仅用于酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）研究的技术快速地向其他模式生物中发展，并在其最初原理的基础上有了较大改进，取得了长足进步。１．　串联亲和纯化（ＴＡＰ）的应用

１９９９年，Ｒｉｇａｕｔ等［１］将两个Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ的ＩｇＧ结合单元（Ｐｒｏｔ　Ａ与钙调蛋白结合肽（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ，　ＣＢＰ）相连，中间以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）的特

收稿日期：２００９－０３－０２

国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３０８００５４０）；教育部重点项目（Ｎｏ．１０８１２８）资助

作者简介：闫昭骐（１９８９－），男，本科生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｚｈａｏｑｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；窦岩梅（１９８９－），女，本科生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｕｙａｎｍｅｉ２００７＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ；杜宏武（１９７４－），男，博士，副教授，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：　ｈｏｎｇｗｕｄｕ＠ｓａｓ．ｕｓｔｂ．ｅｄｕ．ｃｎ

异性酶切位点相隔，这便是最初的ＴＡＰ标签。Ｒｉｇａｕｔ利用该标签成功地在酿酒酵母中纯化出了大量蛋白质复合体，也就此创立了串联亲和纯化技术。短短十年之后，ＴＡＰ与质谱技术（ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，　ＭＳ）联用（ＴＡＰ－ＭＳ）已成为一种高效且实用的方法在生物大分子相互作用领域中被广泛应用。近些年，随着ＴＡＰ标签的全面改进和质谱技术的不断发展，ＴＡＰ－ＭＳ的灵敏度与专一性得到很大提高，使得该技术得以在更多领域发挥重要作用，也使得我们对蛋白质复合体进行系统性研究成为可能。

１．１　ＴＡＰ向各个领域扩展延伸　　　　随着该技术的不断成熟，ＴＡＰ技术迅速向各个领域扩展。如今，ＴＡＰ已经在病毒［２］、细菌、原生动物［３］、植物以及哺乳动物等多个领域发挥着积极作用。

１．１．１　原核生物（以大肠杆菌为代表）　　　　以往对大肠杆菌蛋白质相互作用的研究方法有很多，如免疫共沉淀［４］和ＧＳＴ钓饵（ＧＳＴ　Ｐｕｌｌ　Ｄｏｗｎ）［５］等，但这些方法存在杂蛋白质多、假阳性高等问题，其应用存在一定局限性。２００３年，Ｇｕｌｌｙ等［６］率先运用ＴＡＰ对大肠杆菌酰基载体蛋白（ＡＣＰ）进行研究。他们分别利用Ｎ端ＴＡＰ与Ｃ端ＴＡＰ分离出与ＡＣＰ相互作用的ＭｕｋＢ与Ｉｓｃ蛋白，证明ＡＣＰ还存在其他未被发现的生理功能，同时初步表明了ＴＡＰ技术在原核生物中应用的可行性。

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长期以来，大肠杆菌都是生命科学研究中最重要的模式生物之一，但有关大肠杆菌的系统蛋白质组研究却直到２００５年才由Ｂｕｔｌａｎｄ等［７］进行了首次报道。他们采用ＴＡＰ技术对大肠杆菌１０００个可读框中的８９７个蛋白质添加了ＴＡＰ标签，分别加以分离纯化，并绘制了首张大肠杆菌蛋白质相互作用的网络图谱。该研究不仅证实了许多之前预测的蛋白质复合体，还发现了许多已知蛋白质间新的相互作用，也让我们深入地了解了很多原核生物保守蛋白质间的微观拓扑结构。

作为一种原核生物，大肠杆菌的结构比真核生物简单，导入标签蛋白质的难度也要低于哺乳动物和酵母，且基因易于操控。因此，ＴＡＰ技术在原核生物中应用时选用亲和性较低的传统酵母ＴＡＰ标签即可。因此，在目前有关大肠杆菌ＴＡＰ的报道中，基本都是沿用传统的酵母ＴＡＰ标签（Ｒｉｇａｕｔ实验中所使用的标签）进行研究，少有标签的改进。１．１．２　哺乳动物　　　　ＴＡＰ技术被认为能广泛应用于系统绘制各物种的蛋白质相互作用图谱。该技术目前在绘制人类细胞系统全蛋白质相互作用图谱中也发挥了很大作用。除此之外，ＴＡＰ技术还被应用于研究复杂的生化反应路径及机制，如人类转录机器的研究［８］和鼠胚胎干细胞多能性的研究［９］等。

在研究信号转导途径的过程中，为了探寻α－肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）与核转录因子ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃ－ｔｏｒ　ｋａｐｐａ－ｌｉｇｈｔ－ｃｈａｉｎ－ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｂ　ｃｅｌｌｓ）的分子通路，Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒ等［１０］标记了与该通路相关或疑似相关的３２个蛋白质，采用ＴＡＰ－ＭＳ技术，成功鉴定出与该途径相关的２２１个蛋白质复合体，包括８０个从未发现的相互作用蛋白质以及１０个重要的功能分子。该研究不仅让人们更深入了解ＴＮＦ－α与ＮＦ－κＢ之间的联系，也为我们提供了一条研究其他信号通路以及相关疾病的新方法。

Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒ等［１１］在传统ＴＡＰ标签的基础上进行优化，构造了新的Ｎ端标签，Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒ等在ＰｒｏｔｅｉｎＡ的Ｎ末端连入一段六聚组氨酸序列（６×Hｉｓ）以便于纯化。新标签应用于与Ｒａｓ家系相关的ＧＴＰ酶系的鉴定，他们从小鼠成纤维细胞中分离了蛋白质复合体，采用Ｎａｎｏｆｌｏｗ　ＨＰＬＣ方法分离蛋白质复合物中的各组分，建立了第一个哺乳动物细胞内与Ｒａｓ相互作用的蛋白质数据库。

１．１．３　植物　　　　ＴＡＰ在植物中的应用目前还较有限，由于植物蛋白质表达量较低，而适合植物使用的标签还较少，所以纯化效率不高。目前大多数提纯方案采用传统ＴＡＰ标签［１２，１３］或ＴＡＰｉ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＴＡＰ）标签［１４］。后者针对植物进行了遗传密码子的偏好性改良，并通过改变钙调蛋白亲和蛋白质（ＣＢＰ）序列中核定位序列（ＮＬＳ）的方法扩大了ＴＡＰ标签的应用范围。传统ＴＡＰ标签和ＴＡＰｉ标签都已成功应用于拟南芥［１２］和水稻［１５，１６］蛋白质复合体的提纯。另外，一种替代型ＴＡＰ标签（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ＴＡＰ　ｔａｇ，　ＴＡＰａ）也被报道［１７］，用于纯化拟南芥的蛋白质复合体。ＴＡＰａ中的ＣＢＰ被９×Mｙｃ和６×Hｉｓ序列取代，然后将ＴＥＶ酶切位点换为人鼻病毒３Ｃ酶切位点，使标签专一性和其在低温下的活性得到增强。除此之外，由于该纯化方法不需要使用含有乙二醇双（２－氨基乙醚）四乙酸（ＥＧＴＡ）的缓冲液，依赖阳离子维持稳定性的蛋白酶复合物也可以通过该方法被提纯出来。但是，尽管ＴＡＰａ标签能够应用于蛋白质凝胶印迹和染色质免疫共沉淀实验中［１８］，但用该标签进行串联亲和纯化ＴＡＰ且成功表征出蛋白质复合体的研究实例却并不多见［１７］。２００８年以来，有人开始运用新型ＧＳ－ＴＡＰ标签，即基于Ｐｒｏｔ　Ｇ和链霉抗生物素蛋白结合肽（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ，　ＳＢＰ）的ＴＡＰ标签（具体结构见２．１部分）

［１９］

对植物进行研究［２０］，取得了较好效果，显示出ＴＡＰ

技术在植物蛋白复合物领域也具有一定的应用潜力。１．２　系统蛋白质组研究迈出第一步　　　　除了上面提到的Ｂｕｔｌａｎｄ等进行的大肠杆菌蛋白质组研究，Ｇａｖｉｎ等［２１］用ＴＡＰ－ＭＳ技术对芽殖酵母进行了全基因组筛选，共分离出４９１个复合体，其中２５７个是含有新发现蛋白质的复合体。通过对蛋白质的表达、定位、功能、进化保守性、蛋白质的结构及其相互作用等多方面研究，以及对蛋白质组的模块化分析，该研究最终形成了相对完整的生物信息整合与模拟平台，向系统生物学研究迈出了坚实的第一步。

在Ｇａｖｉｎ等进行实验的同时，Ｋｒｏｇａｎ等［２２］也报道成功标记了与２３５７个酵母诱饵蛋白质结合的４０８７种蛋白质。二者均运用了同源重组的ＴＡＰ方法，使蛋白质组的覆盖率显著提高（高达７２％）。这两次研究的数据重复率仅为１８％，不过分析表明，如果两次研究采用相同的洗脱和分析规则，二者的重复率会有所提高［２３］。与之前的酵母［２４，２５］和大肠杆菌研究［５，７］

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相比，以上两个研究小组的研究成果对全蛋白质组的大规模分析研究做出了开创性的贡献。１．３　与其他技术联用，可发挥ＴＡＰ的更大潜能　　　　人们在逐步改善ＴＡＰ技术自身缺陷的同时，还尝试将其与其它工具联合使用，这使ＴＡＰ在研究蛋白质相互作用领域发挥着越来越重要的作用。

Ｌａｖｏｉｅ等［２６］采用的实验方法能够基于ＴＡＰ、ＨＡ、ＭＹＣ标签进行ＰＣＲ介导的同源重组。标签标记蛋白质可以被用来进行串联亲和纯化或染色质免疫沉淀和基因芯片分析。

Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等［２７］设计了一种新型标签，将八聚组氨酸（８×Hｉｓ）、链霉素结合肽（ＳＢＰ）和Ｃ端Ｍｙｃ标签串联到绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的一个环里，使得这个新型标签具有蛋白质定位和蛋白质纯化双重作用。这种ＴＡＰ与免疫荧光技术相结合的设计为我们更深入了解蛋白质的内部信息提供了方便。２．　ＴＡＰ在发展中出现的问题及对策

２．１　传统ＴＡＰ效率较低，需要使用大量原材料　　　　传统ＴＡＰ技术在应用上遇到了一个很大的瓶颈：研究过程需要大量细胞作为原材料。通常情况下，纯化出可供研究的蛋白质复合体需要大约５×1０８￣１×1０９个细胞，而且须是稳定转染并能够表达诱饵蛋白质的细胞。这在哺乳类动物的细胞培养过程中难度很大。另外，高度分化的细胞中目标蛋白质可能含量很低，在这种情况下，传统ＴＡＰ技术也很难纯化出足够量的蛋白质复合体。

为了使ＴＡＰ具有更高的应用价值对传统ＴＡＰ技术纯化效率方面的改进显得尤为关键。近些年，已经出现许多旨在提高ＴＡＰ纯化效率的改进方案，其中Ｂｕｒｃｋｓｔｕｍｍｅｒ等［１９］改造的ＧＳ－ＴＡＰ（图１）标签最为突出。它使得ＴＡＰ技术在产率上提高了１０倍，从而使原材料的使用量得以大大降低。他们在实验中对传统ＴＡＰ标签进行了改进，用两个具有更广泛亲和性的Ｐｒｏｔ　Ｇ结合单元替代了传统标签中的Ｐｒｏｔ　Ａ，从而提高了蛋白结合率；用洗脱效率更高的ＳＢＰ取代

了传统标签中的ＣＢＰ，提高了蛋白质洗脱率；从而总体提高了蛋白质纯化效率。

Ｂｕｒｃｋｓｔｕｍｍｅｒ等［１９］采用ＧＳ－ＴＡＰ，成功地从用量仅为传统ＴＡＰ方法十分之一的原材料中提取出了足够量的ＤＮＡ结合蛋白Ｋｕ７０／Ｋｕ８０，证明了ＧＳ－ＴＡＰ是一种在哺乳动物细胞中提取蛋白质复合体的有效方法。这种方法不但能节约原始材料，还可以提取到一些体内表达含量很低的蛋白质，从而为筛选鉴定一些新的蛋白质和发现新的调控途径提供了技术条件。

Ｇｉａｎｎｏｎｅ等［２８］在此基础上又设计了５个新型标签（图２），他们用亲和力更强而且分子量更小的Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ　结合肽（８－ｍｅｒ）替换原始的链霉抗生物素蛋白（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）结合肽（３８－ｍｅｒ），引入两个ＴＥＶ蛋白酶切位点以提高酶切效率，并设计了一个含四个半胱氨酸的蛋白质序列（ＣＣＰＧＣＣ），以便运用荧光标记方法检测诱饵蛋白的表达、提纯和定位。研究选用人端粒结合蛋白ＴＲＦ２为诱饵，得到大约６％的回收率，细胞用量为１×1０７￣７×1０７。另外，为了提高诱饵蛋白质的回收率，Ｇｉａｎｎｏｎｅ等［２８］还实施了一种冰冻／解冻裂解的改造方案，以使细胞裂解物尽可能浓缩，最终得到大约１６％的ＴＲＦ２回收率，且ＴＲＦ２结合蛋白富集量明显增大。

在用布氏锥虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ）提取液进行蛋白质鉴定的过程中，针对钙调蛋白亲和蛋白柱效率较低的问题，Ｓｃｈｉｍａｎｓｋｉ等［２９］将传统ＴＡＰ

进行了

图２　Ｄｕａｌ－系列标签结构［２８］

Ｃ：Ｃ端标签；Ｎ：Ｎ端标签；ＣＣＰＧＣＣ：含四个半胱氨酸基因序列；Ｓ：Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ结合蛋白（ＳｔｒｅｐＩＩ－ｔａｇ）；ｔ：烟草蚀纹病毒

图１　ＧＳ－ＴＡＰ标签简图［１９］

ＴＥＶ：烟草蚀纹病毒酶切位点；ＳＢＰ：链霉生物素结合蛋白结合蛋白

。

酶切位点（ＴＥＶ）；Ｐ：ＩｇＧ上Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ结合域（ＰｒｏＡ　ｔａｇ）；Ｈ：６×

组氨酸（Ｈｉｓ　ｔａｇ）；ＨＡ：流感病毒表面抗原血凝素（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ

ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ｅｐｉｔｏｐｅ，　ＨＡ　ｔａｇ）。

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改造，将ＣＢＰ蛋白替换成人ＰｒｏｔＣ（一种对维生素Ｋ依赖的肝细胞特异表达血浆酶原），制成ＰｒｏｔＣ－ＴＥＶ－ＰｒｏｔＡ标签，称为ＰＴＰ标签（图３）。ＰｒｏｔＣ与单克隆抗体ＨＰＣ４亲和度极强，而ＨＰＣ４具有获取钙离子进行抗原识别的特殊性能（即只有在与钙离子作用的条件下才能与ＰｒｏｔＣ反应）。因此，和ＣＢＰ作用相似，ＰｒｏｔＣ标记的蛋白可以用一种二价阳离子的螯合物从ＨＰＣ４上洗脱下来。这种方法克服了钙调蛋白亲和蛋白的低效问题，但在洗脱步骤中，该法回收率比传统的ＥＧＴＡ洗脱法稍低（单步ＥＧＴＡ洗脱回收蛋白率５０％左右，该方法为２１％）。尽管如此，ＥＤＴＡ洗脱在某些情况下会造成蛋白结构的损坏和功能的改变，在这些情况下使用该标签可以维持蛋白质的天然状态，而且使用ＰＴＰ标签总体上蛋白质的回收效率还是有所提高的。除改造标签外，通过把标签中稀有密码子替换为偏爱密码子的方法也可有效地提高蛋白质的表达效率。Ｙａｎｇ等［３０］通过该方法构建了ｈＴＡＰ标签，提高了ＴＡＰ标签在哺乳动物细胞中的表达效率，分离出了转化生长因子β２的分子复合体。

图５　目的蛋白质与ＦＬＡＧ抗原－钙调蛋白结合蛋白Ｎ端标

签结合结构示意简图［３２］图４　ＳＦ－ＴＡＰ简图

［３１］

标签标记的Ｂ－ＲＡＦ表达水平显著低于ＳＦ标记的表达水平。

Ｃａｏ等［３２］也将传统ＴＡＰ标签进行了成功改造，用ＦＬＡＧ标签代替了蛋白Ａ标签，减小了空间位阻，减轻了表达负担；同时，他们将ＦＬＡＧ标签与ＣＢＰ直接连接，在第一步纯化过程中用ＦＬＡＧ肽（ＦＬＡＧｐｅｐｔｉｄｅ）进行洗脱，简化了ＴＡＰ标签的结构（图５）。应用这种改造后的ＴＡＰ技术，将其与ＭＡＲＣＨ２蛋白连接，成功提纯出含有ＤＬＧ１的蛋白质复合体，并通过进一步实验证明了ＭＡＲＣＨ２蛋白催化ＤＬＧ１的泛素

化。

上述两种改造方法选用了小分子标签，有效地

图３　ＴＡＰ和ＰＴＰ标签简图

［２９］

降低了空间位阻带来的风险，也成功地纯化出了目标蛋白质。由于小分子标签空间位阻小和表达负担轻的特点，学界对于小分子标签的探索也日趋增多。

２．２　添加的ＴＡＰ标签可能会影响蛋白质的折叠或者活性　　　　由于ＴＡＰ中要在诱饵蛋白质的一端连接标签，从而不可避免的带来了一定风险，如蛋白质的天然折叠过程可能会由于标签的添加产生变化，从而影响到表达蛋白质的生物学活性，甚至导致无法得到所需的蛋白质复合体。除此之外，还有可能会由于ＴＡＰ添加导致蛋白质构象有所改变而和本来不应该结合的蛋白质发生作用，从而导致蛋白质相互作用鉴定错误。

为尽量减小这些潜在的影响，Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ等

［３１］

２．３　目的蛋白质表达水平可能受到受转入标签的影响带有ＴＡＰ标签的目的基因在导入细胞后，存在很多影响蛋白质表达的不确定因素以及局限性。由于被标签标记的目的基因不在内源性基因启动子的控制下，致使目的蛋白质不一定能顺利地被转录翻译，也不能被细胞内的许多调节因子所调控，因此导致目的蛋白质的表达水平不够正常和稳定。

Ｐｏｓｅｒ等［３３］通过开发细菌人工染色体（ＢＡＣ）转基因组成功地克服了这一问题。ＢＡＣ的长度能够确保几乎所有调节因子的存在，从而使转基因的表达接近体内水平。运用９６孔法可以快速而稳定地引入ＴＡＰ标签（该标签包含一个延长的绿色荧光蛋白ＥＧＦＰ，一个Ｓ－多肽标签和ＴＥＶ蛋白酶切位点）。这种标签可以用来研究标记蛋白质的蛋白质定位（利用荧光蛋白），同时可以通过以标签为基础的芯片来研

设

计了一个新型的ＴＡＰ标签（ＳＦ－ＴＡＰ），ＳＦ－ＴＡＰ标签串联了两个链霉素抗蛋白Ｓｔｒｅｐ－ＩＩ标签和一个ＦＬＡＧ标签（图４），使标签的大小减小到４．６　ｋＤａ。此标签在第一步洗脱中使用去硫生物素，在第二步中使用ＦＬＡＧ多肽。在实验中构建的三个蛋白质复合体中，传统

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究蛋白质－蛋白质以及蛋白质－ＤＮＡ的相互作用。２．４　蛋白质纯化过程不能在完全变性条件下进行　　　　现在的常见标签普遍不能在两步纯化中都与完全变性的条件兼容，而这种严格的纯化条件对质谱分析是十分重要的，因为完全变性条件可以最大限度地保护翻译后又发生修饰变异的蛋白结构。

Ｔａｇｗｅｒｋｅｒ等［３４］把两种在完全失活条件下进行的亲和纯化策略——组氨酸标签和Ｎｉ２＋螯合物胶柱结合策略以及生物素和链霉菌属（ａｖｉｄｉｎｉｉ）抗生素蛋白之间的反应策略组合成一系列ＨＢ标签，发展了一种可以在完全变性条件下进行的两步纯化策略。ＨＢ标签标记的蛋白质在两步纯化中可以耐受完全变性的条件（图６）。

物、原生动物以及哺乳动物等门类中，由于同源重组困难，内源蛋白质会与标记蛋白质进行竞争，从而降低试验灵敏度和成功率。

为解决这个问题，人们采取了ＴＡＰ与ＲＮＡ干扰技术结合的方式，以停止内源蛋白质的合成，从而增加由标记蛋白质形成的蛋白质复合体数量。其中，Ｔｋａｃｚ等［３］利用ＲＮＡ干扰技术和ＴＡＰ标签标记的Ｌｓｍ蛋白（一种多功能蛋白质，对许多ＲＮＡ的核内处理和转化起重要作用）来鉴定Ｌｓｍ２－８复合体的组成部分，结果发现了用于连接Ｕ６　ｓｎＲＮＡ的Ｌｓｍ蛋白（Ｌｓｍ２和Ｌｓｍ５）。

总之，ＴＡＰ标签在许多方面有待改进，最明显的问题是表达效率、细胞用量、以及应用范围等问题。近年来各研究者根据自己的情况设计了许多不同的新型标签，有力推动了提纯蛋白质复合体等研究的进展。３．　展望

针对ＴＡＰ技术的种种问题，学界近些年已经对其进行了各种改进，但大多仅仅是根据自身实验需求进行局部改进。尽管已经有人对现阶段的各种标

图６　各种Ｃ端和Ｎ端ＨＢ标签示意图［３４］

（１）ＲＧＳＨ６：９肽，与Ｎｉ２＋螯合凝胶柱亲和，可被单克隆抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ或ＭＤ）特异性识别；ＢＩＯ：由丙酸杆菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）衍生出的７５个氨基酸序列，在哺乳动物及酵母细胞中可以高效表达；ＴＥＶ：烟草蚀纹病毒酶切位点。（２）ＨＢＨ系列标签包括２个组氨酸标签，在进行Ｎｉ２＋胶柱洗脱时能耐受更苛刻的条件。

签进行了较为系统的整理和比较［３５］，但尚未形成产业化的标签生产。标签种类繁多，但每个标签的适应面较为狭窄，必须针对不同的物种构建不同的标签，较为繁琐。现在已经有人针对此方面进行了探索。比如前文提到的Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，在一个标签中融合了几个具有不同特性的标签，从而使该标签具有较广的适应范围。可以想见，在追求缩小标签尺度的同时，制作大型广谱标签也许会成为未来标签研发的另一个趋势。

２００２年，Ｇａｖｉｎ等［３６］迈出了蛋白质组系统化研究的第一步。随着ＴＡＰ趋于成熟，越来越多的人也开始着手进行系统的全蛋白质组研究。蛋白质相互作用图谱的绘制是“后基因组时代”系统化研究各种生命现象的必由之路，这张地图将对研究生命现象和各种生理行为有着深刻广泛的指导意义。而串联亲和纯化将有望成为这个过程发展中的支柱性研究工具之一，在系统蛋白质组研究过程中发挥更为关键的作用。

参　考　文　献

［１］Ｒｉｇａｕｔ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ

．　Ａ　ｇｅｎｅｒｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ

由于失活条件可以抑制水解酶的活性，这种标签非常适合研究泛素化蛋白。Ｔａｇｗｅｒｋｅｒ等

［３４］

在蛋白

质组谱宽范围内研究了存在于酵母和人体中的泛素蛋白，不仅识别出一批已知的泛素蛋白，还筛选到许多之前没有发现的泛素蛋白。研究证实ＨＢ标签能有效扩展蛋白质复合体的研究范围，使得弱结合的或者瞬时结合的蛋白质复合体也可得以被捕获和提纯。

２．５　内源蛋白质与标记蛋白质的竞争　　　　传统ＴＡＰ在酵母中应用时，是将标签标记蛋白质以同源重组的方式替换原有蛋白质，因此细胞内与目标蛋白质结合的全部蛋白质复合体均由标记蛋白质组成。但在植

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●　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，　１９９９，　１７（１０）：　１０３０－１０３２

［２］Ｆｏｒｓｍａｎ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＥＢＶ－ｅｎｃｏｄｅｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　　ａｎｔｉｇｅｎ　５　ｕｓｉｎｇ　ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＴＡＰ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　ＦＴ－ＩＣＲ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．　ＪＰｒｏｔｅｏｍｅ　Ｒｅｓ，　２００８，　７（６）：　２３０９－２３１９

［３］Ｔｋａｃｚ　ＩＤ　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐｔａｍｅｒｉｃ　Ｌｓｍ　ｃｏｍｐｌｅｘ

ｔｈａｔ　ｂｉｎｄｓ　Ｕ６　ｓｎＲＮＡ　ｉｎ　Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ．　Ｍｏｌ　ＢｉｏｃｈｅｍＰａｒａｓｉｔｏｌ，　２００８，　１６０（１）：　２２－３１

［４］Ｂａａｒｓ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ

ｃｈａｐｅｒｏｎｅ　ＳｅｃＢ　ｕｓｉｎｇ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００６，　２８１（１５）：　１００２４－１００３４

［５］Ａｒｉｆｕｚｚａｍａｎ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ－

ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２．　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ，２００６，　１６（５）：　６８６－６９１

［６］Ｇｕｌｌｙ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｅｗ　ｐａｒｔｎｅｒｓ　ｏｆ　ａｃｙｌ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｂｙ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，２００３，　５４８（１－３）：　９０－９６

［７］Ｂｕｔｌａｎｄ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ

ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００５，４３３（７０２５）：　５３１－５３７

［８］Ｊｅｒｏｎｉｍｏ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ

ｎｅｔｗｏｒｋ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　７ＳＫ　ｃａｐｐｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ，　２００７，　２７（２）：２６２－２７４

［９］Ｚｈｏｕ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．　Ｒａｐｉｄ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｍｏｕｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ

ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　ＥＳ　ｃｅｌｌ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００４，　３２（１６）：　ｅ１２８

［１０］Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｍａｐ　ｏｆ　ｔｈｅ

ｈｕｍａｎ　ＴＮＦ－ａｌｐｈａ／ＮＦ－ｋａｐｐａ　Ｂ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　２００４，　６（２）：　９７－１０５

［１１］Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒ　ＬＥ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｏｆ

ｃａｎｄｉｄａｔｅ　Ｒａｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｊ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｒｅｓ，　２００７，　６（５）：　１８０６－１８１１

［１２］Ｚｈａｏ　Ｑ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｗｏ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｃｌａｓｓｅｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ

ｅｎｖｅｌｏｐｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｒｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＲａｎＧＡＰ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　２００８，　２０（６）：　１６３９－１６５１

［１３］Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ　ａｉｄｓ

ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｖｅｌ　ｒｅｐｌｉｓｏｍｅ　ｆａｃｔｏｒＥＴＧ１．　ＥＭＢＯ　Ｊ，　２００８，　２７（１３）：　１８４０－１８５１

［１４］Ｂａｔｅｌｌｉ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．　ＳＯＳ２　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｐａｒｔ　ｂｙ

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｖａｃｕｏｌａｒ　Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ　ａｎｄ　ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｉｔｓｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　２００７，　２７（２２）：　７７８１－７７９０［１５］Ａｂｅ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｙｎａｍｉｎ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ　ｏｆ　ｒｉｃｅ

ＧＩＧＡＮＴＥＡ　ｂｙ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＴＡＰ）．　Ｐｌａｎｔ　ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，　２００８，　４９（３）：　４２０－４３２

［１６］Ｒｏｈｉｌａ　ＪＳ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ

ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｔａｇｇｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ｉｎ　ｒｉｃｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ，　２００６，　４６（１）：　１－１３

［１７］Ｒｕｂｉｏ　Ｖ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｓｔｒａｔｅｇｙ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，　２００５，　４１（５）：　７６７－７７８

［１８］Ｚｅｎｔｅｌｌａ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｌｏｂａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｅｌｌａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｉｎ　ｅａｒｌｙ

ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　２００７，　１９（１０）：３０３７－３０５７

［１９］Ｂｕｒｃｋｓｔｕｍｍｅｒ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．　ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ，　２００６，　３（１２）：　１０１３－１０１９

［２０］Ｖａｎ　ＬＪ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｏｏｓｔｉｎｇ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ

ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，　２００８，　１３（１０）：　５１７－５２０［２１］Ｇａｖｉｎ　ＡＣ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｓｕｒｖｅｙ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｍｏｄｕｌａｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ

ｙｅａｓｔ　ｃｅｌｌ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００６，　４４０（７０８４）：　６３１－６３６［２２］Ｋｒｏｇａｎ　ＮＪ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｌｏｂａｌ　ｌａｎｄｓｃａｐｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ

ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００６，　４４０（７０８４）：６３７－６４３

［２３］Ｇｏｌｌ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ｅｌｕｓｉｖｅ　ｙｅａｓｔ　ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ．　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌ，

２００６，　７（６）：　２２３

［２４］Ｈｏ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｂｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００２，４１５（６８６８）：　１８０－１８３

［２５］Ｇａｖｉｎ　ＡＣ　ｅｔ　ａｌ．　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ

ｂｙ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００２，４１５（６８６８）：　１４１－１４７

［２６］Ｌａｖｏｉｅ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｔｏｏｌｂｏｘ　ｆｏｒ　ｅｐｉｔｏｐｅ－ｔａｇｇｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ－

ｗｉｄｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ．　ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，　９：　５７８

［２７］Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｒｅｅｎ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔａｇ　ｆｏｒ　ａ　ｗｉｄｅ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，　２００８，　３（１２）：　ｅ３８２２

［２８］Ｇｉａｎｎｏｎｅ　ＲＪ　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｕａｌ－ｔａｇｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｆｆｉｎｉｔｙ

ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００７，　４３（３）：　２９６－３０２

［２９］Ｓｃｈｉｍａｎｓｋｉ　Ｂ　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ　ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｐｉｔｏｐｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．　Ｅｕｋａｒｙｏｔ　Ｃｅｌｌ，　２００５，　４（１１）：　１９４２－１９５０［３０］Ｙａｎｇ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ

ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　２　ａｎｄ　ｔｙｐｅ　Ｘ　　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔａｇ．　Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｂ　ＡｎａｌｙｔＴｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，　２００８，　８７５（２）：　４９３－５０１

［３１］Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ　ＣＪ　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆｎａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，　２００７，　７（２３）：　４２２８－４２３４

［３２］Ｃａｏ　Ｚ　ｅｔ　ａｌ．　ＤＬＧ１　ｉｓ　ａｎ　ａｎｃｈｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｅ３　ｌｉｇａｓｅ　ＭＡＲＣＨ２　ａｔ

ｓｉｔｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ　ｃｏｎｔａｃｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌ，　２００８，　２０（１）：　７３－８２［３３］Ｐｏｓｅｒ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＡＣ　ＴｒａｎｓｇｅｎｅＯｍｉｃｓ：　ａ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｍｅｔｈｏｄ

ｆｏｒ　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｓ．　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，　５（５）：　４０９－４１５

［３４］Ｔａｇｗｅｒｋｅｒ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｔａｎｄｅｍ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｔａｇ　ｆｏｒ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐ

ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｆｕｌｌｙ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ

●　技术与方法

《生命的化学》２００９年２９卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００９，２９（４）

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ｗｉｔｈ　ｉｎ　ｖｉｖｏｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，　２００６，　５（４）：７３７－７４８

［３５］李永进等．　融合标签技术及其应用．　生物工程学报，　２００６，

２２（４）：　５２３－５２６

［３６］Ｇａｖｉｎ　ＡＣ　ｅｔ　ａｌ．　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ

ｂｙ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００２，４１５（６８６８）：　１４１－１４７

The application and development of tandem affinity purification

Zhao-Qi YAN Yan-Mei DOU Hong-Wu DU

(Department of Biotechnology, University of Science and Technology, Beijing 100083, China)

Abstract Tandem affinity purification (TAP), initially used as an approach to study in vivo protein interactions of yeast undernatural state, is now extending to many other fields. At present, TAP has become an important tool to identify as well as purifynew protein complexes, and will hopefully become a key supporting technology in system biology, playing its role in system-atically mapping in vivo multi-protein complexes. But despite its incomparable advantages and wide prospect of application,some problems exist as well. In this paper, problems emerging from the application of TAP in recent years and tag improvementfor different purposes were reviewed. Hopefully, a more efficient and systematic strategy for improving TAP tags will bedeveloped soon to promote the application of TAP in related fields.Key words tandem affinity purification; protein complex; tag