维生素D缺乏动物模型的建立

重庆医学2011年4月第40卷第11期1041

#论 著#

维生素D 缺乏动物模型的建立

常正奇, 张泽华, 罗 飞, 许建中

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(第三军医大学西南医院骨科/全军矫形外科中心, 重庆400038)

摘 要:目的 采用BA LB/c 小鼠建立维生素D(V D) 缺乏模型并进行评价。方法 将BA LB/c 小鼠分成正常组、V D+组及VD-组, 测4~10、12周小鼠体质量, 并观察其运动习性, 8、12周期间饮食消耗; 12周时测血浆VD 、清蛋白水平; 将V D 缺乏老鼠10只分为组Ñ继续遮光加正常饮食, 组Ò正常环境加正常饮食, 6周后测V D 水平。结果 正常组与V D+组体质量比较差异无统计学意义(P >0. 05) ; V D+组与VD-组8周时日平均消耗饲料, 有差异, 12周时无差异; 正常组、V D+组、VD -组血浆清蛋白分别为(33. 2? 1. 04) 、(32. 4? 0. 53) 、(32. 8? 0. 67) g/L, 差异无统计学意义; 正常组与V D+组血浆V D 水平无显著差异, V D-组血浆VD 水平下降到正常的20%以下; 6周后, 组Ñ、组ÒVD 水平分别为(18. 46? 1. 53) 、(58. 46? 5. 53) nmo l/L(P

关键词:维生素D 缺乏; 维生素D 生理作用; BA L B/c 小鼠; 动物模型do i:10. 3969/j. issn. 1671-8348. 2011. 11. 001

文献标识码:A

文章编号:1671-8348(2011) 11-1041-03

To establish the animal m odel of vitamin D deficiency *Chang Zhengqi #, Zhang Zehua, L uo Fei, X u J ianz hong

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(Dep ar tment of Or thop aedics , Southw es t H osp ital , T hird M ilitar y M edical Univ er s ity , Chongqing 400038China) Abstract:Objective T o establish and ev aluate t he animal mo del o f v itamin d deficiency using BA L B/c mice. Methods Put BA L B/c mice into no rmal gr oup, V D+gr oup andV D-g ro up, measur ed the w eig ht of the three g roups of 4-10, 12th w eek; o b -serv ed the mouse act ivity; Reco rded fo od co nsumpt ion dur ing 8and 12th week; A ssay fo r serum albumin and 25-hydro xy vitamin D level after 12w eeks. T hen 10mouse of v itamin D def iciency wer e divided int o tw o g ro ups w ith nor mal diet fo r six weeks, but one gr oup as beginning the ot her one as nor mal g ro up, then measur ed the serum level of 25-hydro xy vit amin D. Results N or ma l g ro up and V D+g ro up had no statistical differ ences in bo dy w eig ht(P >0. 05) ; A t 8th w eek , the averag e consumption o f synthesis foo d in VD+gr oup w as (6. 72? 0. 89) g /d, V D-g ro up w as (5. 82? 1. 34) g /d; A t 12th week times V D+g ro up w as (7. 05? 0. 72) g/d, VD -gr oup w as (6. 67? 0. 84) g /d, ther e w as a lit tle differ ence at 8th w eek but no statistica l differ ences at 12th w eeks; T he plasma albumin o f nor mal gr oup, V D+g r oup, VD -g ro up w ere (33. 2? 1. 04) , (32. 4? 0. 53) , (32. 8? 0. 67) g/L, respect ively. T wo o f the three g ro ups and between the two g ro ups w ere no statistically differ ences; Serum 25-hy dr ox yv itamin D had no significant differences betw een nor mal g ro up and V D+gr oup, but sig nificant differences in V D-gr oup w ith decr eased into nor mal 20%; T he serum 25-hy dr ox yv itamin D o f two deficiency g ro ups after six months wer e (18. 46? 1. 53) and (58. 46? 5. 53) nmol/L (P

Key words:vitamin D deficiency; physiolo gica l effects o f vitamin D; BAL B/c mice; animal model 维生素D(v itamin D, V D) 不仅是维生素, 也可以说是来自皮肤分泌的激素, 有广泛且比较重要的生理作用。VD 缺乏是全世界发病率最高的疾病, 在健康欧洲人中V D 缺乏(

1 材料与方法

1. 1 动物与试剂 怀孕2周的BA LB/c 母鼠36只及生长繁殖饲料(正常饲料) 均购自第三军医大学动物实验中心, VD 缺乏纯合成饲料原料购自重庆化玻有限公司, 不含紫外线黄光灯购自飞利浦公司, V D 检测试剂盒购自IDS 公司。

1. 2 V D 缺乏小鼠饲料配制 将双蒸水50L 平均分装到容量为50L 的金属桶装容器中, 分别加入625g 琼脂, 于105e 加热40min, 然后放入到60e 的保温箱中备用。将比例[3]称量的各种原料放入混合机中混合30min 后加入到无尘粉碎机中粉碎, 全部一次性通过200目。将其平均分两份分别加入到琼脂溶液中, 并加入脂溶性维生素溶液各250mL [3](一份含VD, 一份未含) , 充分搅拌30min, 室温下冷却1h, 然后放入到-20

*基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(30901174) 。

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通讯作者, Tel:[1**********]; E -mail:treas ureyu qing@qq. com , E -

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e 冰箱中冻存。

1. 3 V D 缺乏小鼠模型的建立 将36只怀孕2周的BAL B/c 小鼠随机分为3组, 单笼饲养。正常组喂正常饲料、自来水, 清洁级饲养; V D+组喂V D+饲料、自来水, 清洁级饲养; V D-组喂V D-饲料、自来水, 超净工作台饲养。V D -组将鼠笼放入超净工作台, 工作台四周内部用门板遮盖, 外部用不通光布帘遮盖, 12h 通风一次, 用不含紫外线黄光灯白天12h 照射, 夜间熄灯。怀孕母鼠在放入笼中6d 左右产子鼠, 子鼠出生3周断奶, 饲养环境同母鼠, 同时剔除雄性子鼠, 不同窝小鼠分开饲养。最终去除死去小鼠的数据, 正常组、V D+、VD -组分别剩余18、15、13只。检测4~10、12周小鼠体质量, 8、12周时测每天饮食消耗量, 同时观察小鼠运动习性。

1. 4 检测血浆V D 、清蛋白 12周时将上述3组小鼠剪尾取血100L L 离心取血浆测V D 水平, 每组随机取3只小鼠摘眼球取血, 测清蛋白水平; 将V D 缺乏老鼠10只随机分为组Ñ继续遮光加正常饮食, 组Ò正常环境加正常饮食, 6周后摘眼球取血测V D 水平。

1. 5 统计学处理 实验数据用SPSS17. 0软件进行统计学分析, 组间差异用单因素方差分析, 两两比较用LSD 检验; VD +组与V D-组饮食消耗比较采用配对t 检验。2 结 果

2. 1 3组BA L B/c 小鼠的体质量 从第4周开始进行饲料喂养, 每周记录小鼠体质量变化。结果显示, 正常组与VD +组每周体质量比较差异无统计学意义(P >0. 05) , 见图1。提示

配方饲料能够给小鼠提供足够的营养。

3 讨 论

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提示V D 缺乏小鼠模型建立成功(图2) 。

2. 5 再次饲养后血浆V D 水平 VD 缺乏BA LB/c 小鼠组Ñ、组Ò饲养6周后, 测其血浆VD 水平分别为(18. 46? 1. 53) 、(58. 46? 5. 53) nmol/L 。组Ñ小鼠V D 水平稍有升高, 但仍远低于正常水平; 而组Ò小鼠血浆V D 水平接近正常。

2. 6 小鼠活动习性 V D 缺乏小鼠从出生6周开始活动量较正常组及V D+组明显减少, 并且贴地行走, 导致8只小鼠腹部有(1~3) cm @(1~2) cm 左右的皮肤脱毛。

图2 3组小鼠血浆VD 水平

3. 1 人为干预V D 缺乏的理论 V D 是固醇类衍生物, 有5种, 对健康关系较密切的是VD 2、V D 3, 均为VD 原经紫外线照射后的衍生物[4]。25-O HD 为血清中多种VD 代谢产物中含量最多且最稳定的一种, 其血清浓度可代表机体V D 营养状态。人体每天需要1000IU V D 才能使体内的25-O HD 达到50nmo l/L [5], 但无论植物还是动物主要是含VD 原(需要紫外线照射) , 从食物中得到的V D 很难超过100IU , 远无法满足机体的需要。由此所知维生素的来源主要是日光照射皮肤生成, 多余的可以贮存在脂肪及肝数月[6]。在建立动物模型的时候从3个方面进行, 确保BA LB/c 小鼠体内VD 缺乏:(1) 日光中的紫外线照射对V D 生成至关重要[7], 采用遮光, 用不含紫外线黄光灯照射, 饲养地为四周木板遮挡加不透光布围绕的超净工作台(可保证清洁级饲养及经常透风) ; (2) 采用的饲料为纯合成饲料, 完全不含VD 原, 更不含VD; (3) 考虑到VD 可以贮存在脂肪及肝数月, 为使试验小鼠饲养前体内VD 降到最低, 缩短建模时间, 作者采用二代小鼠饲养12周。试验结果显示其体内V D 水平降至10nmo l/L 以下, 完全符合公认的维生素缺乏标准。

3. 2 V D 水平及其生理作用 VD 的主要功能是调节体内钙、磷代谢, 减少骨质疏松及骨折的风险; 另外其作用于V D 受体, 直接或间接调控200多个基因, 减少癌细胞的增生, 并诱导其末端分化[8], 发挥免疫调节作用[9], 明显减少许多慢性疾病(癌症、自身免疫性疾病、传染性疾病及心血管疾病等) 的罹病风险。关于血浆中对所有器官都适合的VD 浓度目前还无法确定, 但小于25nmo/L 被认为缺乏, 可能导致佝偻病或骨软化症[10]; 小于50nmol/L 被认为不足, 可能导致一系列慢性疾病[11]; 50~100nmo l/L 时属于可代偿范围[12]; 100~150nmo l/L 目前被认为健康水平。本试验中正常组、V D+组、V D -组V D 水平分别为(64. 9? 8. 23) 、(76. 1? 8. 18) 、(9. 2? 2. 26) nmol/L , 所以, 此动物模型从VD 水平上看完全达到缺乏标准。观察V D 缺乏老鼠活动明显减弱且肚皮贴地行走, 减, 图1 3组小鼠体质量变化图

2. 2 8、12周V D+组与V D -组饮食区别 8周时日平均消耗合成饲料V D +组为(6. 72? 0. 89) g , V D -组为(5. 82? 1. 34) g; 12周时V D+组为(7. 05? 0. 72) g , VD -组为(6. 67? 0. 84) g 。8、12周时两组小鼠每天饮食消耗量经成对t 检验, 8周时P

2. 3 3组BA L B/c 小鼠血浆清蛋白水平 喂养到12周时检测血浆清蛋白水平, 正常组、V D+组、V D-组血浆清蛋白分别为(33. 2? 1. 04) 、(32. 4? 0. 53) 、(32. 8? 0. 67) g/L , 3组之间血浆清蛋白含量差异无统计学意义(P =0. 762) , 正常组与V D +组差异无统计学意义(P =0. 479) , V D+组与V D-组差异无统计学意义(P =0. 707) , 正常组与V D-组差异无统计学意义(P =0. 730) 。

2. 4 3组BAL B/c 小鼠血浆VD 水平 正常组、V D+组、V D -组血浆V D 水平分别为(64. 9? 8. 23) 、(76. 1? 8. 18) 、(9. 2? 2. 26) nmol/L 。正常组与V D +组血浆V D 水平无显著差

异, , ,

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Anderson 等[13]建立的动物模型比较, 本研究3组小鼠体内VD 偏低, 排除鼠种原因外, 正常组与V D+组主要因为清洁级饲养过滤紫外线较多导致, V D +组也与合成饲料中添加V D 较少有关, V D-组则可能因为遮光较为彻底。

3. 3 本研究建立的动物模型的合理性 目前, 用于V D 缺乏疾病研究的动物包括猪、狗、大鼠和小鼠。在动物的选择上作者考虑到小鼠易行、经济, 且关于VD 缺乏疾病的研究已经从佝偻病转向免疫、肿瘤、心血管等疾病研究[14], 逐步进展到细胞及分子水平, 小鼠完全可满足需要, 并且小鼠与人类的同源性最好; 应用纯合成饲料, 根据化学及物理因素来造动物模型, 造成V D 缺乏与人类有较高的相似性, 在建立的动物模型中再次设计3个指标即体质量、饮食消耗及血浆清蛋白, 从体质量上观察V D+组与正常组小鼠体质量差异无统计学意义, V D +组与V D-组饮食消耗在8周时稍有差异, 12周时差异无统计学意义, 随体质量趋于稳定后饮食差别消失, 血浆清蛋白水平3组小鼠间差异无统计学意义, 所以, 纯合成饲料的营养状况可以满足小鼠的生长需要; 通过控制光照及饲料中V D 含量控制V D 水平, 具有较高的可控性, 并且作者在第一期试验结束后通过调整饮食及光照6周后发现, 遮光组体内V D 稍有升高, 但仍然为缺乏, 不遮光组基本回复到正常水平, 证明光照较饮食对体内VD 水平的维持更重要。BA L B/c 小鼠VD 缺乏模型的优点有制作方法简便易行、成本低、结果可靠、周期短、成功率高、重复性好等, 因此, 是VD 缺乏系列疾病的一种较好的动物模型。

总之, V D 也被称为/疾病预防的明日之星0[15], 与之相关的研究越来越多, 在本文建立的动物模型中通过控制V D 来源造成其缺乏, 对其相关疾病的深入研究有重要意义。但是, 任何一种动物模型都不能全部复制出人类疾病的所有表现, 只可能在一个局部或一个方面与人类疾病相似。所以, 模型实验结论的正确性是相对的, 需要根据实际情况进行调整、完善。参考文献:[1]

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(收稿日期:2010-10-02 修回日期:2011-01-12)

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