心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验探究

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究中山大学硕士学位论文

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究

专业：急诊医学

学位申请入：罗志刚

导师：黄子通教授

中文摘要

心肺复苏后多器官功能障碍综合征是机体心跳停止发生缺血缺氧及复苏后全身缺血再灌注后出现的一组机体功能紊乱的症候群，其特征表现为炎症因子、黏附分子的大量产生和调节异常，机体发生内毒素血症甚至严重的脓毒血症，使组织细胞出现弥漫性损伤，最终导致多器官功能衰竭的发生。研究发现复苏后患者２ｄ内血浆内毒素水平显著升高，缺血再灌注会导致肠道相关淋巴组织凋亡增加，淋巴细胞数量减少，肠道粘膜免疫屏障功能在细菌移位中的作用受到广泛关注。目前对肠道屏障功能的研究大多在休克和脓毒症方面，而心肺复苏后肠道屏障功能的改变国内尚未见研究，新近观点认为心肺复苏后患者的生存率不仅仅由及时的血流动力学恢复决定，其中心博骤停及复苏所产生的缺血再灌注的病理过程，及后续的器官损伤也有重要关系。本课题拟研究心肺复苏后的大鼠肠道屏障功能，并且探讨其在复苏后多器官功能不全的可能影响。

研究目的

本实验采用大鼠电刺激诱发心室颤动和机械性心肺复苏模型，研究复苏成功后大鼠肠道粘膜机械屏障和免疫屏障功能的改变。

材料和方法

首先建立大鼠电刺激诱发心室颤动（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｆｉ晡１ｌａｔｉｏｎ，ＶＦ）和机械性心

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究中山大学硕士学位论文肺复苏模型，实验动物分为两组：复苏成功组（ｎ．３０），对照组（ｎ＿３０）。复苏成功组和对照组于１，２，３，５，７ｄ距回盲部８ｃｍ取回肠标本，制作ＨＥ病理片及ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８，ＳＩｇＡ浆细胞免疫组化片。镜下观察病理情况，回肠粘膜损伤指数，及半定量法分析免疫组化结果。

结果

复苏组各时间点血流动力学统计无差异（ｐ＞Ｏ．０５），基础值与对照组比较统计学无差异（ｐＯ．０５），体重改变情况复苏组与对照组比较，第１ｄ体重变化统计学无差异（ｐ＞０．０５），第２，３，５，７ｄ体重变化统计学有差异（ｐ＜０．０１），对照组从第２ｄ开始即出现体重增加并且超过实验前，而复苏组第３ｄ才出现体重增加，且到第７ｄ体重才超过实验前。病理形态观察１，２，３ｄ损伤明显，第３ｄ可以观察到修复现象。回肠粘膜损伤指数两组间第１，２，３ｄ有统计学差异（ｐ＜Ｏ．０１），尤其以第１ｄ明显。免疫组化结果提示复苏后第２，３天ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８，ＳＩｇＡ浆细胞减少，统计学有差异（Ｐ＜０．０５），且以ＣＤ４，ＣＤ８细胞数量减少最为明显。

结论

（１）心肺复苏后大鼠肠道粘膜机械屏障受损，以第１，２，３ｄ明显，第３ｄ可以

观察到修复现象。

（２）心肺复苏后大鼠肠道粘膜免疫屏障受损，ＣＤ４，ＣＤ８细胞数量减少最为明显。

关键词肠道粘膜屏障；心肺复苏后多器官功能不全；缺血再灌注

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究中山大学硕士学位论文ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＧｕｔＢａｒｒｉｅｒｏｆＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ

ａｆｔｅｒＣａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙＲｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｉｎＲａｔｓ

Ｍａｊｏｒ：Ｅｍｅｒｇｅｎ呵Ｍｅｄｉｃｉｎｅ

Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：Ｌｕｏｚｈｉｇａｎｇ

ＳｕｐｅｒＶｉｓｏｒ：Ｐｒｏ．Ｈｕａｎｇｚｉｔｏｎｇ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＰｏＳｔｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｄｉｓｅａｓｅｉｓ

ｉｓｃｈｅｍｉａａＩｌｄａｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎｏｆｄｉｓｏｒｄｅｒｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｗｈｏｌｅ－ｂｏｄｖｒ印ｅ血ｓｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｉｔｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｈｉ曲ｌｅｖｅｌｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｋｉｎｅｓ跚ｌｄａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｔｌｌｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｅｎｄｏｔｏｘｉｎｉｎｐｌａＳｍａａ１１ｄｏ玛ａｎｄｙｓｆＩｌｎｃｔｉｏｎ：ａｐｒｏｆｉｌｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｓｅｅｎｉｎＳｅＶｅｆｅｓ印ｓｉｓ．Ｓｔｕｄｙｒ印ｏｒｔｓｔｈａｔｅｎｄｏｔｏｘｉｎｉｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ’ｐｌａＳｍａｗｉ也ｉｎｆｉｒｓｔ２ｄａｙｓ，ａｎｄＧＡＬＴｌｙｍｐｈｙｏｃｙｔｅｍｕｍｂｅｒｍａｒｋｅｄｌｙｒｅｄｕＣｅｓａＲｅｒ

ｂａｃｔｅｒｉａｓｅＶｅｒｅｇｕｔＩ／王之．Ｒｅｎｃｅｎｔｌｙ，ｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｍｏｒｅａｔｔｅｎｔｉｏｎ．

ｆｅｗｒｅｐｏｒｔｓｏｎｔｒ锄ｓｌｏｃａｔｉｏｎ，Ｇｕｔ－弱ｓｏｃｉａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｉｄｔｉｓｓｕｅ（ＧＡＬｒ）ｇａｉｎｓＴｈｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｇｕｔｂ捌ｅｒａｒｅｒｃｐｏｒｔｅｄａｂｏｕｔｓｈｏｃｋａｒｌｄｓ印ｓｉｓ，甜ｌｄ

ＣＰＲｉｎｃｈｉｎａ．Ｒｅｃｅｎｔｒｅｐｏｒｔｓｏｆｌｌｉｇｌｌｅｒｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ臼ｅａｔｅｄｗｉｔｈ１１１ｉｌｄｈｙｐｏｔｈｅｍｉａ

ｄｅｔｅｍｌｉｎｅｄａｎｅｒｓｕｃｃｅｓｓ如ｌｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ矗．ｏｍｃａｒｄｉａｃａｒｒｅｓｔｃｏｎｆｉｍｔｈａｔｏｕｔｃｏｍｅｉｓｎｏｔｏＩｌｌｙｂｙｔｌｌｅｔｉｍｅｔｏｃｉｒＣｕｌａｔｉｏｎｒｅｃｏＶｅｒｙｂｕｔａｌｓｏｂｙｐａ廿ｌｏｇｅｎｉｃ

ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙｔ１１ｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓｔｈａｔ

ｃａＩｌＳｉｎｇａｒｅｃ砌ｉａＣａｒｒｅｓｔ，ｔｌｌｅｎｃｏｎｔｉｎｕｅ

ｏｎｔｏｅｖｏｌＶｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｄ锄ａｇｅｔ０ｏ玛锄ｓ．ＴｈｅｎｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａＩｌｇｅｏｆｇｕｔｂａ玎ｉｅｒ硪ｅｒＣＰＲ柚ｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａＩｌｉｓｍｏｆｅ虢ｃｔＰＲ．ＭＯＤＳ．

ＯｂｊｅｃｔｉＶｅ

Ｔｂｓｔｕｄｙｔｈｅ

ＣＰＲｏｎａｃｈ锄ｇｅｏｆｔｈｅｇｕｔＩｎｕｃｏｓａｌｂａ仃ｉｅｒａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏ西ｃｂａ玎ｉｅｒａｆｔｅｒｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｉｎｄｕｃｅｄＶｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ舶ｒｉｌｌａｔｉｏｎ（ＶＦ）ａｎｄｍｅｃｈ锄ｉｃａｌｃｈｅｓｔｃｏｍｐｒｓｓｉｏｎａｎｄＶｅｎｔｉｌａｔｉｏｎｄ谢ｎｇｃ刹ｉｏｐｕｌｍｏｎａＤ，ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ（ＣＰＲ）．

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究中山大学硕士学位论文ＭａｔｅｒｉａｌａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｔｍｏｄｅｌ，Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙｒａｔｓｄｉＶｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅｒａｔｓ

ｒａｔｓｓｕｃｃｅｓｓｍｌｌｙｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｓｐｏｎｔａＩｌｅｏｕｓｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（ＲＯＳＣ）（ｎ＝３０），ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ

（ｎ＝３０）．Ｔｈｅｔｉｓｓｕｅｏｆ也ｅｉｌｅｕｌ［Ｉｌｗａｓｈ锄Ⅳｅｓｔｅｄｃｌｏｓｉｎｇ

１，２，３，５，７ｄａｙ．１ｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｃｈａＩｌｇｅｓａｎｄｍｕｃｏｓａｌ

ｌｌｌｌｄｅｒｔｏｉｌｅｏｃｅｃａｌｊｕｎｃｔｉｏｎ８ｃｍｏｎｔｈｅｄ锄ａｇｅｇｒａｄｉｎｇ、ｖｅｒｅｏｂｓｅⅣｅｄａＩｌｄＩｇＡｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．．弧ｅｃｈａｎｇｅｓ０ｆＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８Ｔｌｙｎｌｐｈｏｅｙｔｅｓ

ｐｌ踟ｏｃｙｔｅｓ

ＲｅｓｕｌｔｓｎｕｍｂｅｒｏｆｉｌｅａｌｍｕｃｏｓａＪａｎｄｌ锄ｉｎａｐｒｏｐｒｉａｏｆｔｈｅｄｉｓｔａｌｅｎｄｏｆｉｌｅａｌｍｕｃｏｓａｌｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｖｉＩｎｍｕｏｌｌｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｌｌｏｄ．

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ｔｌｌｅｃｏｎｔｒｏｌｈｅｍｏｄｙｎ锄ｉｃｓ

ｗｅｉｇｈｔｈａＳｎｏｄｉａ’ｅｒｅｎｃｅｂｅ铆ｅｅｎａｌｓｏｈａＳｔｗｏ

ｏｎｔ量ｌｅＲＯＳＣｇｒｏｕｐｓａ１１ｄｇｒｏｕｐ（ｐ＞０．０５），ａ１１ｄｔｈｅＨｅｍｏｄｙｎ锄ｉｃｓｂｅｔｗｅｅｎｎｏｎｏｄｉ虢ｒｅｎｃｅｈ弱ｉｎＲＯＳＣｇｒｏｕｐｓ（ｐ＞Ｏ．０５）．ＴｈｅｃｈａＩｌｇｅｓｔｈｅｇｒｏｕｐｓｔｈｅ１ｓｉｇｎｉｆｉｃ锄ｔｄｉ腩ｒｅｎｃｅｏｎｔｌｌｅ２，３，５，７ｄａｙｓ（ｐ＜Ｏ．Ｏ１），ｂｕｔｄｉ疏ｒｅｎｃｅｄａｙ（ｐ＞Ｏ．０５）．１１１ｅ

ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓｗｅｉｇｈｔｉｎｃｒｅａＳｅｆ．ｒｏｍｔｈｅ２ｄａｙａｎｄｓｕｒｐａｓｓｔｈｅｅｘｐｅ＾ｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｌｌｅＲＯＳＣｇｒｏｕｐｓｉｎｃｒｅａｓｅｆ而ｍｔｈｅ３

Ｔｈｅｄａｙ锄ｄｓｕ叩ａｓｓｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｍａｔｉｏｎ咖ｉｌｍｅ７ｄａｙ．ｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｉｇｌｌｉｆｉｃａｎｔ蜘诚ｎｇ

ｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄ

ｏｎｏｎｏｆｍｅｇｕｔｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｃａｌｌａｆｔｅｒＣＰＲ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｏｎⅡ１ｅｌ，２ａ１１ｄ３ｄａｙｓ，ａＩｌｄｔｈｅｒｅｐａｉｒｉｎｇｏｆｔｈｅｎｍｃｏｓａｌｃａｎｂ硎ｅｒｔｈｅ３ｄａｙｓ．Ｔｈｅｍｕｃｏｓａｌｄａｎｌａｇｅｇｒａｄｉｎｇｂ娟Ⅳｅｅｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓｈａｕｓｄｉ虢ｒｅｎｃｅｔ１１ｅ１，２，３ｄａｙｓ（ｐ＜ｏ．０１），ｓｉ嘶ｆｉｃａｎｔｄｉ虢ｒｅｎｃｅ０ｎｔｈｅ１

ｂｅ“旧ｅｎｔｌｌｅＲＯＳＣｇｒｏｕｐｓａ１１ｄｔｈｅｄａｙ．Ｔｈｅｎ啪ｂｅｒｔｌｌｅ２，３ｏｆＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８ＴｈａｖｅｏｂｖｉｏｕｓｌｙｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｎｄＩｇＡｐｌａｓｍｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅ铲ａｄｕａｌｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ锄ｄｏｎｄｉ虢ｒｅｎｃｅＳｈ锄ｇｒｏｕｐｓ

ｄａｙ（ｐ＜ｏ．０５），ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ

ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＣＤ４ａｎｄＣＤ８．

（１）１１１ｅ刖ｍｕｃｏｓａｌ

锄ｄ３ｂａｒｒｉｅｒｗ硒埘谢ｅｄａ船ｒｃａｎＣＰＲ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｏｎ也ｅ１，２ｏｎｄａｙｓ，觚ｄｒｅｐａｊｒｉｎｇｏｆｔｈｅｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｂｅｏｂｓｅｎ，ｅｄｔ１１ｅ３ｄａｙｓ．

ｏｆ（２）ｎｌｅｇｕｔｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｂａｒｒｉｅｒｗ船蠲谢ｅｄ硪ｅｒＣＰＲａｎｄｔｈｅ删啪ｂｅｒ

ＣＤ４锄ｄＣＤ８ＴｌｍｐｈｏｃｙｔｅｓｄｅｃｒｅａｓｅｄＳｈａ印ｌｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ

ｇｕｔｂａｒｒｉｅｒ；ｐｏｓｔ—ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｍｕｌｔｉｐｌｅ０ｒ舒ｍｄｙｓ如ｎｃｔｉｏｎｓ），ｌｌｄｒｏｍｅ；ｉｓｃｌｌｅｌｌｌｉａ．ｒｅｐｅｒ如ｓｉＯｎ

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中英文缩写词表

ＣＰＲ

ＲＯＳＣｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏ鲫叮ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｓｐ０毗ａ１１ｅｏｕｓ心肺复苏术自主循环恢复ｃ沁ｕｌａｔｉｏｎ

ＰＲ－ＭＯＤＳｐｏｓｔ－ｒｅｓｕｓｃ胁ｉｏｎｍｕｌｔｉｐｌｅｏ曙觚ｄｙｓ矗姬ｃｔｉｏｎｓｙｌｌｄｒｏｍｅ

心肺复苏后综合征

ＶＦ

ＡＣ

ＰＣ

ＣＰＰｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ心室颤动Ｃ砌ｉａｃＡ盯ｅｓｔＰｒｅｓｓＣｈｅｓｔ心跳骤停胸外按压冠状动脉灌注压

平均动脉压

ｔｉｓＳｕｅ

ＡＣｏｒｏｎａ巧Ｐｅｒ向ｓｉｏｎＰｒｅｓｓｕｒｅＭＡＰＧＡＩＴＳＩｇＡ

ＩＥＬ

ＬＰＬＭｅａｌｌＡｎｅｒｉａｌＰｒｅｓｓｕｒｅＧｕｔ－ａＳｓｏｃｉａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｉｄ肠道相关淋巴组织分泌型免疫球蛋白Ａｓｅｃｒｅｔｏｒ），ｉＩＩｌｒｎ＿ｕＩｌｏ西ｏｂｕｌｉｎｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ１ａｍｉｎａｐｒｏｐｒｉａｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ

Ｐｅｙｅｒｐａｔｃｈｅｓ肠上皮内淋巴细胞固有层内淋巴细胞派伊尔集合淋巴小结ＰＰ结

ＭＬＮｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｌｙｍｐｈｎｏｄｅ肠系膜淋巴结淋巴细胞

原创性声明

本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者签名：弘缈Ｊ

日期：２砖年６月岁日

学位论文使用授权声明

本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。学位论文作者签名：害细１日期：沁３年６月ｒ日

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究中山大学硕士学位论文

第１章引言

随着现代心肺复苏（ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａ巧ｒｅｓｕｓｃｉ协ｔｉｏｎ，ＣＰＲ）技术和急诊医务人员技术水平的不断提高，心跳骤停患者得到及时有效的救治，复苏患者自主循环恢复（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｓｐｏｎｔ觚ｅｏｕｓｃｉｒＣｕｌａｔｉｏｎ，Ｉ的ＳＣ）率不断提高，可达４Ｏ％～６０蜊１１。

心跳骤停后，机体发生强烈的应激反应，神经、内分泌、血管活性物质都发生了剧烈改变，复苏后组织器官发生缺血再灌注损伤，机体有可能发生全身炎症反应综合征（ｓｙｓｔｅｍｉｃｉ１１ｆｌａｍｍａｔｏ巧ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＳＩＲＳ），进而出现多器官功能障碍综合征（ｍｕｌｔｉｐｌｅｏ珞ａ１１ｄｙｓｆＩｍｃｔｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＭＯＤＳ），称为复苏后多器官功能障碍综合征（ｐｏｓｔ—ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｍｕｌｔｉｐｌｅｏ略ａｎｄｙｓ丘ｍｃｔｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲ．ＭＯＤＳ）。

ＰＲ－ＭＯＤＳ是机体心跳停止发生缺血缺氧及复苏后全身缺血再灌注后出现的一组机体功能紊乱的症候群，其特征表现为炎症因子、黏附分子网的大量产生和调节异常，机体发生内毒素血症甚至严重的脓毒血症，使组织细胞出现弥漫性损伤，最终导致多器官功能衰竭的发生。

ＣＰＲ患者发生ＰＲ．ＭＯＤＳ，导致患者病死率增加，出院率只维持在２％～２２％的水平【３棚。ＰＲ．ＭＯＤＳ是复苏患者ＲＯＳＣ后死亡的主要原因。

ＰＲ－ＭＯＤＳ的发病机制尚不十分清楚，可能原因是机体炎性反应、缺血再灌注损伤、细胞凋亡等多因素共同参与。

１．１缺血再灌注损伤在ＰＲ—ＭＯＤＳ中的作用

在心跳骤停期间，全身组织严重缺血、缺氧，此期低氧血症被认为是造成组织损伤的主要原因，氧摄取障碍妨碍了线粒体氧化磷酸化，非需氧途径成为ＡｒＰ唯一来源，结果造成细胞内ＡＴＰ含量下降，全身所有脏器均受到损害。ＣＰＲ患者ＲｏＳＣ后，血液对组织器官产生再灌注，随之出现细胞线粒体内呼吸链氧自

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究中山大学硕士学位论文由基大量产生；中性粒细胞被激活，发生呼吸爆发，产生大量的氧自由基；再灌注时次黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶作用分解为尿酸，亦生成大量氧自由基，造成组织细胞膜脂质过氧化，通透性增加。再灌注期间组织细胞的钙超载，造成组织广泛变性、坏死，并与缺血期损伤持续时间显著相关。此外，再灌注期间凝血和补体活化产物及细胞因子释放引起中性粒细胞活化，粘附分子表达上调１２Ｊ，活化的中性粒细胞与内皮配体结合后，移行出血管外组织损伤部位，血管内皮细胞严重损伤，引起微血管通透性增加和血栓形成，导致ＭＯＤＳ的发生。

１．２缺血再灌注对肠道的损伤

心肺复苏后根据缺血的持续时间和组织的损伤程度可大致经历四个阶段ｒ７】：（１）最初的２４小时，机体组织广泛的缺血缺氧，微循环障碍和组织再灌注损伤，导致毒素酶和氧自由基大量产生和释放入血。（２）ｌ至３天，心脏功能和大部分器官功能有所恢复，但是由于肠道结构损害，通透功能增加‘８’９１，导致细菌移位，机体脓毒素血症，多器官功能不全的发生。（３）继发严重感染的发生，机体迅速的衰竭。（４）机体最终死亡。

肠道在缺血缺氧时，由于小肠绒毛营养血管的结构特点，肠绒毛顶端最容易发生缺血性损害，使得肠粘膜上皮水肿，致肠组织细胞坏死，上皮从绒毛顶端脱落，甚至粘膜全层脱落，而形成溃疡，缺血再灌注后肠道屏障功能损伤导致通透性增加‘瓢９】，细菌易于移位和内毒素入血。再灌注肠道也被认为是中性粒细胞Ｑ）ｏｌｙｍｏ印ｈｏｎｕｃｌｅａｒｎｅｕｔｒｏｐｌｌｉｌｌｅｌｌｌ（ｏｃｙｔｅｓｏｒＮｅｕ加ｐｌｌｉｌｓ，ＰＭＮＳ）启动的最初部位ｆ姗，大量炎症因子如ＴＮＦ—ａ，ＩＬ一６等产生【２１，导致机体全身炎症反应综合征，及脓毒症样改变甚至多器官功能不全。研究发现，ＣＰＲ成功后，患者２ｄ内血浆内毒素水平显著升高【２】，可能是复苏后机体免疫功能受损或肠道黏膜屏障丧失等原因而导致肠道细菌移位，肠道内细菌及内毒素进入血液中出现败血症及内毒素血症。

最近研究发现，缺血再灌注会导致肠道相关淋巴组织（Ｇｕｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌ舯ｐｈｏｉｄｔｉｓｓ．∞，ＧＡＬＴ）凋亡增加，数量减少Ｉ¨】，肠道抗感染的功能降低，肠道细菌的移位途径可能跟肠Ｇ√６岍有关１１１．１２１。肠道粘膜免疫屏障功能在细菌移

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究中山大学硕士学位论文位中的作用受到广泛关注。

目前对肠道屏障功能的研究大多在休克和脓毒症方面，而心肺复苏后肠道屏障功能的改变国内尚未见研究，新近观点认为心肺复苏后患者的生存率不仅仅由及时的血流动力学恢复决定，其中心博骤停及复苏所产生的缺血再灌注的病理过程，及后续的器官损伤也有重要关系【１３’１４１，本课题拟研究心肺复苏后的大鼠肠道屏障功能，并且探讨其在复苏后多器官功能不全的可能影响。

本实验的总体研究思路为：

首先建立大鼠电刺激诱发心室颤动和机械性心肺复苏模型，复苏成功后的大鼠采用ＨＥ染色病理学方法观察肠道粘膜组织的变化，免疫组织化学方法观察肠道相关淋巴组织细胞（ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８，ＳＩｇＡ浆细胞）的改变。

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第２章材料与方法

２．１实验动物，主要试剂和仪器

清洁级健康ＳｐｍｇＩｌｅ—Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄性大鼠，由中山大学附属第二医院动物房提供（具有实验动物合格证号）

（１）动物实验心肺复苏仪器（中山大学附属第二医院专利受理号

２００６２００６３２６１．９，２００６１００３７１５４．３）

（２）数据采集系统（ＷｉｎｄａｑＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ，美国）

（３）压力传感器（ＢＤ）

（４）除颤仪器（ＺＯＬＬ公司）

（５）分析天平（上海医疗仪器厂）

（６）戊巴比妥钠（４５ｍｇ／ｌ（ｇ，ＳｉｇＩＩｌａ）

（７）肝素钠（广州白云山制药厂）

（８）中性甲醛

（９）水浴锅

（１０）二甲苯

（１１）梯度酒精：无水乙醇，９５％乙醇，７０％乙醇

（１２）封裱剂：甘油和０．５舢０１几碳酸盐缓冲液（ｐＨ９．Ｏ～９．５）等量混合（１３）ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ７．２～７．４）：ＮａＣｌ１３７姗ｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ２．７哪０１几，Ｎａ２ＨＰ０４

４．３姗０１几，ｌ（Ｈ２Ｐ０４１．４姗０１几。

（１４）Ｏ．０１ｍ０１／Ｌ柠檬酸盐缓冲液（ＣＢ，ｐＨ６．Ｏ，ｌ０００ｍ１）：柠檬酸三钠３９，柠

檬酸Ｏ．４９。

（１５）Ｏ．５ｍｏｌ几ＥＤＴＡ缓冲液（ｐＨ８．Ｏ）（北京中山生物技术公司）

（１６）正常山羊血清封闭液

（１７）ＣＤ３小鼠抗大鼠单克隆抗体（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ公司）

（１８）ＣＤ４兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德公司）

心肺复苏后大鼠肠道屏障功能的实验研究

（１９）ＣＤ８兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德公司）（２０）ＳＩｇＡ兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德公司）

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（２１）抗兔二抗即用型试剂（北京中山生物技术公司）

（２２）ＤＡＢ显色剂（武汉博士德公司）

（２３）抗小鼠二抗即用型试剂（北京中山生物技术公司）

（２４）倒置相差显微镜（ＮＩＫＯＮ公司）

２．２实验方法

２．２．１实验分组

ＳＤ大鼠随机分为两组：心肺复苏组（ｎ＝３０，观察时间点为ｌ，２，３，５，７ｄ；

每个观察时间点为６只．），对照组（ｎ－３０，对照组仅进行与复苏组相同的插管操作）。

２．２．２大鼠交流电电刺激诱发心室颤动和机械性心肺复苏模型的建立

（１）心跳骤停和心肺复苏机械装置

本装置包括诱发室颤的致颤器和心肺复苏装置两部分。致颤器为电流可调节

的交流电输出装置。心肺复苏机械装置包括气缸胸外按压控制部分、呼吸控制部分。由于整个系统由电磁阀控制系统同步控制，结果是机械呼吸与胸外按压按照

１：２的比例同步联动。

（２）动物准备

选用健康清洁ＳＤ雄性大鼠，体重４５０±５０９。动物术前一晚禁食但可自由饮水。Ｃ０２麻醉后１％戊巴比妥钠（４５ｍｇ／１（ｇ）腹腔注射麻醉。仰卧位固定于操作板

匕。

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（３）手术操作

ａ）消毒皮肤后，在大鼠颈部胸骨上窝以上一横指处沿颈前正中线切一ｌ锄

的纵向切口，钝性分离软组织到气管。

ｂ）触及气管后经由前端弯曲１４５。的探针外套１４号鞘管经口气管插管，然后拔出探针保留鞘管。固定气管导管，必要时吸痰。

ｃ）分离左股动脉，在动脉下端放置眼科镊阻断血流，远心端结扎，在结扎

处上方用眼科剪剪一小口，放置２３号ＰＥ．５０聚乙烯管到达剑突下（胸主动脉处），

然后缝线结扎动脉切口的近心端固定动脉导管。

ｄ）分别分离双侧颈静脉，以同样方法由左颈静脉放置２３号ＰＥ．５０聚乙烯管

到右心房，由右颈静脉放置４号电极导管。

ｅ）手术操作和试验过程持续监测动物肛门温度，用加热灯保持体温在３７士Ｏ．５

℃。

（４）实验数据采集和分析

ａ）在肢体和体表插入针头电极连接多导生理参数仪持续监测肢体ＩＩ导联心电图。由股动脉和左侧颈静脉导管连接压力传感器与多导生理参数仪相连分别持续监测动脉压和右房压力，连接导管内充满５ＩＵ／『ｍｌ肝素盐水。

ｂ）将多导生理参数仪模拟数据经数据采集卡采集后经模数转换引入到电脑，

通过专用软件实时记录数据并保存在电脑中。

ｃ）实验结束后调出保存的实验数据进行分析。冠状动脉灌注压（Ｃｏｒｏｎ哪

Ｐｅｒ：ｍｓｉｏｎＰｒｅｓｓｕｒｅ，

ＣＰＰ）定义为主动脉舒张压和右房舒张压之差。

（５）电刺激致颤

心尖部皮下插入负极针头，经右侧颈静脉电极导管插入电极钢丝（正极）到右心室内膜，由体表心电图确认电极放置位置。以经心室的回路进行交流电刺激诱导ＶＦ，由体表心电图和动脉血压变化确认诱导ＶＦ成功后维持诱导３ｌＩｌｉｎ。

（６）心搏骤停和复苏的程序

ａ）手术操作完成后待实验大鼠血压、心率、体温等生理参数稳定后，记录基础值，准备开始心搏骤停和心肺复苏。

ｂ）准备电刺激诱导室颤前ｌＯｍｉｎ开始机械通气（潮气量Ｏ．６５ｍ１／１００９），吸入氧浓度２１％。

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ｃ）低于１０ｍＡ交流电经触及右心室内膜指引钢丝和体表负极针头形成的交流电回路持续致颤３ｍｉｎ后停止，随后继续观察５ｒｎｉｎ，共进行８ｍｉｎ无处理室颤。

ｄ）致颤８ｍｉｎ后开始频率为２００次／ｍｉｎ的胸外按压和ｌｏｏ次／ｌ：１１ｉｎ的同步机

械通气，吸入氧浓度为１００％，按压深度为胸廓前后径的１／３。

ｅ）心肺复苏６ｍｉＩｌ后，连续给予最多３次的２Ｊ双向波除颤，如果动物没有

恢复自主循环，重新开始３０ｓ的胸外按压和机械通气后再次除颤，直至动物恢复

自主循环。若３个循环后动物仍未恢复自主循环则宣布复苏失败。自主循环恢复ＲＯＳＣ定义为恢复室上性心律，平均动脉压≥６０ｍｍＨｇ并且维持５ｍｉｎ以上。

ｆ）动物ＲＯＳＣ后继续纯氧机械通气３呖ｉＩｌ，连续监测２ｈ血流动力学。然后

拔除所有导管，放入笼中饲养，自由进食及饮水。

２．２．３标本检测

（１）实验动物记录体重变化，于ｌｄ，２ｄ，３ｄ，５ｄ，７ｄ致死动物开腹取回肠组织标本（距离回盲部８ｃｍ）。生理盐水冲洗肠腔后，放入中性甲醛液中固定。

（２）制作ＨＥ标本，光镜下肠道形态学观察及回肠上皮损伤指数测定，免疫组织化学测定肠道Ｔ细胞亚群及浆细胞的改变（ＣＤ８，ＣＤ４，ＣＤ３，ＩｇＡ浆细胞）。

２．２．４

ＩＨＣ—Ｓ．Ｐ法流程

ａ）组织切片放置于ＰＨ６．０柠檬酸盐缓冲液中煮沸３０分钟，物理冷却至室温，

ＰＢＳ冲洗，３分钟×３次。

ｂ）用非免疫的羊血清工作液封闭组织切片１０分钟，倾去溶液，勿洗。ｃ）滴加一抗（ＣＤ３，分钟×３次。

ｄ）滴加即用型生物素化二抗在３７℃孵育３０分钟，ＰＢＳ冲洗，３分钟×３次。ｅ）滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，在３７℃孵育３０分钟，

ＣＤ４，

ＣＤ８，

ＳＩｇＡ）在４℃下孵育过夜，ＰＢＳ冲洗，３

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ＰＢＳ冲洗，３分钟×３次。

ＤＤＡＢ／Ｈ２０２反应染色，ＰＢＳ液充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

２．３统计学处理

采用ＳＰＳＳｌ３．０统计软件包统计分析，数据以均数±标准差表示，所有计量资料进行正态性、方差齐性检查，非正态性及方差不齐者，进行自然对数转

换，多组计量资料间的差异性用方差分析，等级资料采用秩和检验。

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第３章

结果

３．１血流动力学数据

（１）复苏组复苏前与对照组基础ＭＡＰ比较统计学无差异（ｐ＞０．０５）（见表３．１，图３．１）。

（２）复苏组ＡＣ、ＰＣ时ＭＡＰ比较统计学无显著差异∽Ｏ．０５），复苏后血压

（Ｉ的ＳＣ３０、Ｉ的ＳＣ６０ＭＡＰ）比较统计学无差异（ｐ＞Ｏ．０５）（见表３．１，图３．２）。

表３．１：血流动力学数据表

图３．１：Ｉ的ＳＣ组与Ｃｏｎ仃ｏｌ组基础ＭＡＰ比较

１４０．ＯＯ

１２０．００

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ＭＡＰ

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图３．２：复苏组ＡＣ、ＰＣ、ＲＯＳＣ３０、ＲＯＳＣ６０ＭＡＰ比较

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３５７

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Ｂ：Ｐ

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Ｃ时ＭＡＰ比较

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７

矗ｍｅ（ｄ）

矗ｍｅ（ｄ）

Ｃ：ＲＯＳＣ３０ＭＡ

Ｐ比较Ｄ：ＲＯＳＣ６０ＭＡＰ比较

３．２体重改变情况

（１）复苏组与对照组比较，第１ｄ体重变化统计学无差异（ｐＯ．０５），第２，３，５，７ｄ体重变化统计学有差异（毒ｐ＜Ｏ．０１）（见表３．２，图３．３）。

（２）对照组从第２ｄ开始即出现体重增加并且超过实验前，而复苏组第３ｄ才出现体重增加，且到第７ｄ体重才超过实验前（见表３．２，图３．３）。

表３．２：体重改变情况表

组别

堡重墼銮！曼１

１ｄ

２ｄ牛

３ｄ章

５ｄ摹

７ｄ搴

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图３．３：体重改变情况

－－－－一ｃｏｎ缸Ｄ１

一－—求ＯＳＣ

Ｏ．０００

－５．０００

２３５

石ｍｅ（ｄ）

３．３大体标本观察的比较

解剖大鼠肉眼观察可见到复苏组的第１，２，３ｄ肠壁、肠系膜有水肿表现，蠕动减弱，黏膜表面还有散在出血点，其中第１ｄ明显出现肠腔鼓胀的表现。

３．４

ＨＥ染色病理标本

３．４．１各个时间点镜下所见（附图）３．４．２回肠粘膜损伤指数

（１）回肠粘膜损伤指数采用Ｃｈｉｕ肠粘膜损伤评分：Ｏ分：正常粘膜绒毛；１

分：上皮下Ｇｕｒｅｌｌｌｌｇａｌｌｅ间隙增大，通常在绒毛的尖端，常伴随有毛细血管淤血；

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２分：上皮下间隙扩张伴随上皮层同固有层的中度分离；３分：绒毛两侧上皮层大量的同固有层分离，部分绒毛顶端破损；４分：绒毛破损伴随固有层毛细血管暴露，可能观察到固有层的细胞成份增多；５分：固有层破坏和不完整，出血和溃

疡。

（２）ＲＯＳＣ组回肠粘膜损伤指数１、２、３ｄ组与对照组比较统计学有差异

（毒ｐ＜０．０１）提示ＲＯＳＣ后第１、２、３ｄ肠道粘膜明显损伤。（见表３．３）

表３．３：各组Ｃｈｉｕ回肠粘膜损伤评分

３．５免疫组化分析

采用ＩＩｌｌａｇｅｐｒ０巾ｌｕｓ６．０生物专业图象分析软件进行光密度分析，指标用ＩＯＤ

和ｄ锄ｓｉｔｙ表示。（其中Ｏ为复苏前对照，ｄｅＩｌＳ毋为ＩＯＤ／ａｒｅａ）

３．５．１

ＣＤ３免疫组化结果分析

（１）ＩｏＤ、ｄｅｎｓｉｔｙ组问（ＡＮｏｖＡ方差分析）：统计学有差异（ｐ＜０．０５）；１、２、

３、５ｄ与对照比较（０组）比较统计学有差异（木ｐ＜Ｏ．０５），并且呈减少趋势，提示ＣＤ３在ＲＯＳＣ后减少，以第３ｄ最为明显；７ｄ与０比较统计学无差异（ｐ＞０．０５），提示

ＲＯＳＣ后第７ｄＣＤ３细胞数量可能恢复（见表３．４，图３．１４）。

（２）ＲＯＳＣ组内比较：７ｄ与ｌ、２、３、５ｄ比较统计学有差异（木ｐ＜０．０５）；１ｄ与

３ｄ组别比较统计学有差异（△ｐ＜Ｏ．０５）；２ｄ与５ｄ组别比较统计学有差异

（▲ｐ＜０．０５）；

３ｄ与５ｄ组别比较统计学有差异（※ｐ＜０．０５）。１、２、３ｄ呈减少趋

势，以第３ｄ最少，第５ｄ开始增加（见表３－４，图３—１４）。

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表３－４：ＣＤ３免疫组化半定量分析

图３．１４：ＣＤ３免疫组化半定量分析

咖０咖Ｏ湖０咖０

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Ｏ．１５００

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０．１２００

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３

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１

２

３

５

７

矗ｍｅ（ｄ）

Ａ：ＩＯＤ

矗ｍｅ（ｄ）

Ｂ：ｄｅｎｓ匆

３．５．２

ｃＤ４免疫组化结果分析

（１）ＩｏＤ、ｄｅｎｓｉｔｙ组间（ＡＮＯＶＡ方差分析）：统计学有差异（ｐ＜０．０５）；１、２、

３ｄ与对照比较（Ｏ组）比较统计学有差异（却＜０．０５），并且呈减少趋势，提示ＣＤ４

在ＲｏＳＣ后减少，以第３ｄ最为明显；５、７ｄ与Ｏ比较统计学无差异（ｐ＞Ｏ．０５），提示ＲＯＳＣ后第５ｄＣＤ４细胞数量可能开始恢复（见表３—５，图３．１５）。

（２）ＲｏｓＣ组内比较：７ｄ组别与１、２、３ｄ组别比较统计学有差异（木ｐ＜０．０５）；２ｄ组与５ｄ组别比较统计学有差异（▲ｐ＜０．０５）；３ｄ组别与５ｄ组别比较统计学有差异（※ｐ＜０．０５）；ｌｄ组与５ｄ组别比较统计学无差异（ｐ＞０．０５）。１、２、３ｄ呈减少趋势，以第３ｄ最少，第５ｄ开始增加（见表３．５，图３．１５）。

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表３．５：ＣＤ４免疫组化半定量分析

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图３．１５

８０００００．Ｏ

ＣＤ４免疫组化半定量分析

▲※

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▲※

ａ

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３

５

７

Ｏｌ２３５７

石ｍｅ（ｄ）

Ａ：ＩＯＤ

石ｍｅ（ｄ）

Ｂ：ｄｅｎｓ匆

３．５．３

ＣＤ８免疫组化结果分析

（１）ＩＯＤ、ｄｅｎｓｉｔｙ组间（ＡＮｏｖＡ方差分析）：统计学有差异（ｐ＜Ｏ．０５）；组内比较，Ｏ与２、３ｄ、５ｄ组别比较均统计学有差异（木ｐ＜Ｏ．０５），并且呈减少趋势，提示ＣＤ８在ＲｏＳＣ后减少，２、３ｄ减少明显；７ｄ与０比较统计学无差异（ｐ＞Ｏ．０５），提示ＲｏＳＣ后第７ｄＣＤ３细胞数量可能恢复（见表３．６，图３一１６）。

（２）ＲＯＳＣ组内比较：表３．６，图３．１６）。

１、２、３、５、７ｄ两两比较统计学无差异（ｐ＞０．０５）（见

表３．６

ＣＤ８免疫组化半定量分析