比色法测定_苯丙氨酸含量的研究

安徽农业科学, Journal of Anhui Agri . Sci . 2008, 36(35) :15294-15296责任编辑　张杨林　责任校对　吴晓燕

比色法测定β2苯丙氨酸含量的研究

韩秋敏　(江苏食品职业技术学院生物工程系, 江苏淮安223003)

摘要　[目的]建立快速、准确的β2苯丙氨酸含量定量方法。[方法]依据α2氨基酸与茚三酮显色反应的原理, 对比色法定量检测β2苯

ββμ丙氨酸进行研究, 探讨2苯丙氨酸浓度、pH 值、反应温度和时间对显色反应的影响。[结果]当2苯丙氨酸浓度在480～620g/ml 时,

显色反应颜色变化明显且显色较稳定, 吸光值控制在0. 05～1. 00; 当pH 值在6～10时, 显色反应颜色变化明显; 当温度为90℃时, 加热

α20m in 左右即有明显的颜色变化。2氨基酸与茚三酮显色反应最适的反应条件为pH 值6. 0、温度90℃、反应时间25m in 。在480～620

μg/ml 范围内, β2苯丙氨酸含量与吸光值呈良好的线性相关关系。[结论]该方法具有操作简便、快速等特点, 适用于一般实验室的样品分析及β2苯丙氨酸转化过程中的产品检测。

β2关键词　苯丙氨酸; 茚三酮; 比色法

+

中图分类号　Q 946. 819　　文献标识码　A 　　文章编号　0517-6611(2008) 35-15294-03Study on the D eterm i n a tion of β2phenyl a l an i ne w ith Color im etr ic M ethod HAN Q iu 2m i n 　(Depart ment of B ioengineering, J iangsu Food Science College, Huaian, J iangsu 223003) Abstract 　[Objective]The rap id and accurate testing method of β2phenylalanine was researched . ]on the p rinci p le of color reacti on bet w een am ino acid and ninhydrin, many fact ors, such as β2phenylalanine and reaction ti m e, in the method of colori m etry deter m inati on of β2phenylalanine was studied . β2phenylalanine concen 2tration was the 480-620μg/ml, there was the obvious change in color and the abs or p tion value was contr olled among 0. 05t o 1. 00. W hen the pH value was in the change in color reacti on . W hen the temper 2ature was 90℃for 20m in heating, the col or change clear . The op of color reaction of α2am ino acid and ninhydrin was the pH value of 6. 0, the temperature of 90℃ti me . n range of 480-620μg/ml, β2phenylalanine concentration and absorp tion value was a good method was si m p le and convenient and could be app lied for the analysis of samp les in general and of 2phenylalanine during the p r ocess of p r oduct transfor mati on .

β2Key words 　N Colori metry

β2　　氨基酸主要是作为自然界中特殊天然产物的组分存

[1]

在, 如肽、环肽、糖肽、寡肽、类碱和萜类等。这些含β2氨基酸结构的化合物对表现强的生物学和生理学特性是至关重要的, 因此, 含β2氨基酸结构的化合物是新药开发的母体结β2。苯丙氨酸(32phenylalanine ) 即32氨基232苯基-丙氨酸(32a m ino 232phenyl -alanine ) 是β2氨基酸中一种重要的氨

[3-6]

基酸, 具有重要的生物和医学用途。但是β2氨基酸在自构

然界中的丰度远小于α2氨基酸, 种类有限, 而且分离提取困难, 难以满足研究需要, 因此, 人工合成β2苯丙氨酸就逐渐成为研究热点, 主要有化学法和生物法。但由于化学法合成的反应步骤多、收率低、拆分效果差等原因, 所以用生物催化方

[4]

法制备光学纯的β2苯丙氨酸及其衍生物的研究备受青睐。在拆分制备光学纯β2苯丙氨酸过程中, 需建立快速、准确的

β2定量方法。苯丙氨酸本身不具颜色, 但通过茚三酮显色反应, 可以方便地对该物质进行定量测定。笔者对其影响因素等进行研究, 旨在为一般实验室的样品分析及拆分制备光学

纯β2苯丙氨酸过程中的产品检测提供参考。

1　材料与方法1. 1　材料

1. 1. 1　试验仪器。BS224S 电子天平(北京塞多利斯仪器系

[2]

1. 2　方法

1. 2. 1　溶液配制。缓冲溶液的制备:配制pH 值6. 0的Na 2HP O 4-NaH 2P O 4缓冲溶液

[7]

。β2苯丙氨酸标准液的配

制:用天平准确称取1. 0000g β2苯丙氨酸标准品, 溶于1L 缓冲溶液中。再采用逐级稀释法配得浓度为480、500、520、

570、620μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液。茚三酮试剂的制备:称取0. 5g 茚三酮溶于100m l 水中得到浓度5g/L的茚三酮水溶液(由于茚三酮不稳定, 现配现用) 。

1. 2. 2　最佳波长的测定。固定pH 值、反应温度和时间、茚

三酮用量, 以540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液进行显色反应, 用分光光度计在370～580n m 范围内测其吸光度, 取吸光值最大且显色稳定的波长为显色波长。

1. 2. 3　标准曲线的绘制。分别吸取浓度480～620μg/ml

β2苯丙氨酸标准液5m l 于10m l 的比色管中, 各加入1m l 的茚三酮试剂, 加上塞充分摇匀。将其置于90℃下水浴25

m in, 冷却至室温, 用722型分光光度计在570n m 下测得其光

密度值。以标准液的光密度值和浓度作一标准曲线。

1. 2. 4　样品的测定。配制一定浓度的样品, 稀释样品浓度

于480～620μg/ml, 调pH 值为6. 0。按相同的反应条件进行反应和比色。由以上所得标准曲线对应查得待测稀释液的浓度即为β2苯丙氨酸待测液的浓度。为检验方法的准确性, 向每1m l 被测样品中分别加入20、40μg 的β2苯丙氨酸纯品检测β2苯丙氨酸的含量。

1. 2. 5　茚三酮显色反应的影响因素分析。①以不同浓度的

统有限公司) ; 722S 可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司) ; pHS 23C 精密pH 计(上海热电仪器有限公司) ;

CS5012SP 型超级数显恒温器(重庆慧达试验仪器有限公司)

β21. 1. 2　试剂。苯丙氨酸(国药集团化学试剂有限公司) ; 茚三酮(上海试剂三厂) ; Na 2HP O 4、NaH 2P O 4、氢氧化钠, 盐酸等试剂均为市售分析纯。

作者简介　韩秋敏(1976-) , 女, 山东高唐人, 硕士, 讲师, 从事生物化

学与分子生物学研究。

收稿日期　2008210213

β2苯丙氨酸在相同的条件下进行显色反应, 分析β2苯丙氨酸

浓度的影响。②以540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液在不同

pH 值下进行显色反应, 分析pH 值的影响。③以540μg/ml

的β2苯丙氨酸标准液在不同的温度及反应时间下进行显色反应, 分析温度及反应时间的影响。

36卷35期　　　　　　　　　　　　　　　　　　韩秋敏　比色法测定β2苯丙氨酸含量的研究15295

2　结果与分析

2. 1　茚三酮显色反应结果

2. 1. 1　波长的选择结果。一定物质在一定波长下, 其消光

系数是一个定值。同一物质在不同波长下测得的消光系数不同, 消光系数值越大, 表示该物质对该波长的光吸收能力越强, 测定分析的灵敏度也越高

[8]

, 因此, 试验过程中要选取

消光系数值最大处的波长。由图1可知, 波峰处为570n m, 所以取570n m

为最佳吸收波长。

β2图2　苯丙氨酸的标准曲线

F i g . 2　St andard curve of β2phenyl al an i n e

表2　2of s ample

βon of

OD 570

μg/ml ∥

Concentrati on detected

519

540560

β2图1　苯

F i g . 1　Absorpti on map of d al an i n e

and n i n ⅠⅢ

0. 3240. 4570. 576

　注:Ⅰ为β2苯丙氨酸待测稀释液; Ⅱ、Ⅲ为每1m l 分别加入了20、40μg

β2苯丙氨酸纯品的稀释液。

　Note:Ⅰ. D iluent sa mp le of β2phenylalanine; Ⅱand Ⅲmean adding 20and

40μg diluent of pure β2phenylalanine in 1m l sa mp le .

2. 1. 2　根据茚三酮比色法测得的一

组数据(表1) 绘制标准曲线(图2) 。由结果可知, β2苯丙氨酸浓度在480～620μg/ml 范围内与茚三酮反应, 表现出由浅紫到紫色的颜色递增的变化, 此时底物浓度与吸光值具有良好的线性关系, 回归曲线方程为y =0. 0054x -2. 4185(x 表

2

示浓度; y 表示吸光度) , R =0. 9972。因此选定β2苯丙氨酸的反应浓度线性范围为480～620μg/ml 。

表1　不同β2苯丙氨酸标准液的光密度值

　　Table 1　O pti ca l den sity of di fferent st andard li qu i ds of β2phenyl 2

al an i n e

2. 2　茚三酮显色反应的影响因素分析结果

β22. 2. 1　苯丙氨酸浓度的影响。由表3可知, β2苯丙氨酸在浓度为480μg/ml 才可以和茚三酮的水溶液进行显色反应。

随β2苯丙氨酸浓度的变大, 显色逐渐变深。当浓度大于800μg/ml 时, 所显颜色过深且其光密度值超出量程。当β2苯丙氨酸浓度在480～620μg/ml 时, 颜色变化明显, 且显色较稳定, 吸光值控制在0. 05～1. 00范围内, 因此选定该浓度范围为测定范围。

β2表3　苯丙氨酸浓度对显色反应的影响

Table 3　Effects of β2phenyl a l an i n e concentrati on on color reacti on

β2μg/ml 苯丙氨酸浓度∥β2phenylalanine concentrati on

[***********]600620

颜色变化

Col or change

浅紫L ight pur ple

吸光值

Abs or p ti on value

0. 161

0. 2950. 3650. 4700. 5880. 6870. 8120. 927

浅紫浅紫浅紫紫色紫色紫色紫色

L ight pur ple L ight pur ple L ight pur ple Pur p le Pur p le Pur p le Pur p le

β2μg/ml 苯丙氨酸浓度∥β2phenylalanine concentrati on

[***********]800

颜色变化

基本无色Basicly col orless

OD 570

0. 0540. 1610. 4700. 9271. 7741. 9161. 997

　注:90℃下水浴25m in, β2苯丙氨酸标准液5ml, 茚三酮水溶液1m l,

pH 值6. 0。表3～4同。

略带浅紫L ittle light pur ple

浅紫L ight pur ple 紫色Pur p le

蓝紫B luish vi olet 蓝紫B luish vi olet 蓝紫B luish vi olet

　Note:Waterbath is conducted f or 25m in under 90℃, standard liquid of

β2phenylalanine is 5ml with ninhydrin 1m l and 6. 0pH. The sa me

as Table 3and 4.

2. 2. 2　pH 值的影响。由表4可知, 显色反应随pH 值的不

同, 颜色有明显的变化。pH 值过高、过低都不发生显色, 而

pH 值在6～10时, 颜色变化明显。溶液pH 值过高, 如pH 值

2. 1. 3　样品测定结果。将被测样品稀释后, 由该法检测浓

度为519μg/ml 。由表1可知, 当向每1m l 样品中多加入20、

40μg 的β2苯丙氨酸纯品时, 所测得的结果即落入相应的浓

在14以上, 即使加热也不显色, 主要原因是茚三酮在强碱性下极不稳定, 容易被强碱所分解, 且茚三酮的水溶液在碱性条件下溶液本身带有明显的淡黄色。在强酸性介质中, 虽然能增强茚三酮或1, 32茚三酮羟基的反应能力, 却大大降低了参与缩合反应的氨基、羟基等新核基团的活性, 使有色的缩合产物形成困难。因此pH 值选定在6左右较好, 此时基本

度区间。这说明该方法的准确度较高, 适于β2苯丙氨酸的定量检测。

15296　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年

无颜色干扰且显色稳定。

表4　pH 值对显色反应的影响

Table 4　Effects of pH value on the color reacti on

pH 值

法拆分的乙酰化反应中, 无其他氨基酸, 故该影响因素可忽略不计。

3　讨论

OD 570

颜色变化

2无色Col orless 46

0. 0338紫色Pur p le 0. 196100. 47014

OD 570

pH 值颜色变化

(1) 由于该类反应尚未发现有文字记载, 其反应机理还

0. 535

需论定。笔者在参阅了一些文献资料的基础上, 对其反应机

理和过程进行分析。借鉴α2氨基酸与茚三酮反应。茚三酮溶液与氨基酸共热生成氨; 氨与茚三酮和还原性茚三酮反应, 生成蓝紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比, 可通过测定570n m 处的光密度, 测定氨基酸的含[7]

量。茚三酮不仅与α2氨基酸作用, 也与某些β2氨基酸和伯、仲脂肪胺等作用, 生成相似的有色物质

。　　(2) 颜色产物是通过缩合形成的, 推理β2苯丙氨酸与茚

[7]

无色Col orless

浅紫L ight pur ple 蓝紫B luish vi olet 0. 659无色Col orless -

　注:β2苯丙氨酸浓度均为540μg/ml 。

　Note:The concentrati on of β2phenylalanine is 540μg/ml .

2. 2. 3　温度及反应时间的影响。由表5可知, 温度和反应

时间对该显色反应的影响也很大。以浓度540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液在70℃进行显色发应时, 发现即使加热35

m in 也基本无颜色变化; 当温度为80℃时, 加热30m in 以上

三酮反应机理与α2氨但是这些机理并不包括反应的全过程, 各种, , 各种结构的有色物质参考文献

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[11]

[10]

才有颜色变化; 而当温度为90℃时, 加热20m in 左右即有明显的颜色变化, 沸水加热时颜色变化也很明显。但考虑到蒸发的影响, 所以试验选用90℃作为最佳反应温度。在显色反应中, 说, 当β2苯丙氨酸浓度在480～620μ℃20

m in 即可反应。, 。另外, 有色缩合物

, 反应中间产物也可能通过其他形式的缩合形成

。该类反应的产物与反应过程分析

及探讨是否合理, 可采用红外及质谱方法进一步验证和确认。

显, 25表5　　　Table 5　Result of color reacti on under d i fferent te mpera ture and

reacti on ti m e

反应时间∥m in

Reacti on 1520253035

反应温度70℃反应温度80℃反应温度90℃

Reacti on

Reacti on

Reacti on

无色Col orless 无色Col orless 无色Col orless

无色无色无色无色

Col orless Col orless Col orless Col orless 无色无色无色浅紫浅紫

Col orless 浅紫Col orless 浅紫L ight pur p le 浅紫

Col orless

L ight pur p le L ight pur p le L ight pur p le L ight pur p le

　注:β2苯丙氨酸标准液5m l; 茚三酮水溶液1m l; β2苯丙氨酸浓度540

μg/ml, pH 值6. 0。

　Note:Standard liquid of β2phenylalanine is 5m l with 1m l ninhydrin s olu 2

ti on, 540μg/ml β2phenylalanine and pH 6. 0.

2. 2. 4　其他影响因素。茚三酮的不同溶剂对显色反应也有

影响。有研究表明, 茚三酮的丙酮溶液在80℃以上时显色较好, 而茚三酮的水溶液要在90℃以上时显色才明显。茚三酮的用量对显色反应的影响不大, 可选择5m l (或3m l ) 被测液与1m l (或0. 5m l ) 茚三酮溶液反应。测定时, 最好选择β2苯丙氨酸标准样与待测稀释液一同水浴, 这样可提高测定的准确度。此外, 当被测样品中含有其他氨基酸时也可与茚三酮发生显色反应, 从而影响测定结果。但在β2苯丙氨酸酶

[9]