细胞培养基本知识
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细胞培养基本条件
1、合适的细胞培养基
合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2、优质血清
目前,大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3、无菌无毒细胞培养环境
无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡。因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度
维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。
5、合适的气体环境
气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。
细胞培养基种类与基本成分
细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便。
1、合成培养基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质: 氨基酸
氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物
碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
无机盐
培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ~320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
缓冲系统
大多数细胞所需pH 在 7.2 - 7.4。但是,细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。
由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2 体系进行缓冲,因此,气相中的CO2 浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中CO2 浓度设定在5%,培养液中NaHCO3 的加入量为1.97g/L;如果CO2 浓度维持在10%,培养液中NaHCO3 的加入量为3.95g/L。
细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换。HEPES 是一种非离子缓冲液,在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力,但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作为pH 指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色。 维生素
在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源,但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。
其它成分
在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的DMEM 培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol ,2-Me )。2-Me 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基,其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成,增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用,已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞。2-Me 是一种小分子还原剂,极易氧化。分子量为78.13,纯的2-Me 是一种无色有刺激味的液体,比重为1.110-1.120(Do20),常用终浓度为5×10-5M 。常配制成0.1M 的储存液,用时每升培养液加0.5ml 。
液体培养基保存:
液体培养基应于4℃冰箱避光保存,实验前放入37℃预热。未加血清液体培养基有效期为12 个月。液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。如果细胞生长不良,可以再添加适量L-谷氨酰胺。
干粉培养基保存:
4℃冰箱避光保存,有效期36 个月。
血清
细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清是最常用的血清,分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清,如厂家能做到这一点,新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质,其质量明显不如前两种。
血清的质量,种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长,而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同,尤其是对克隆细胞的生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。因此,在购买大量血清之前,必须对血清支持细胞生长能力进行检测,然后再大量购买质量好的同一批号的血清,并注意以下几点:
(1)需要长期保存的血清必须储存于-20℃– 70℃低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。
(2)一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。
(3)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃至 -70℃低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶
解1 天。然后移入室温,待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。
(4)热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分(complement )灭活。除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量。补体参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。
(5)切勿将血清在37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。
(6)血清中的沉淀物絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除,也可不用处理。 显微镜下“小黑点”:经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。
细胞培养环境
1、实验室设计
细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁、空气清新,干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。
2、常用设施及设备
(1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式、直流式和外流式三大类。
(2)无菌操作间:一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
(3)操作间:普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物
(4)洗刷消毒间:烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
(5)分析间:显微镜、计算机及打印机等。
3、培养器皿
常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。
(1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液、血清等液体,常用规格有500ml 、250ml 、100ml 等几种。
(2)培养瓶:根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀,便于细胞贴壁生长和观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于1cm ,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有200ml 、100ml 、50ml 、25ml 、10ml 等几种。
(3)培养皿:用于开放式培养及其它用途。分直径30mm 、60mm 、120mm 等几种。
(4)吸管:常用的有长吸管和短吸管两类,长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管,刻度吸管用于移动液体。常用1ml 和10ml 两种。短吸管也叫滴管,分弯头和直头两种。
(5)离心管:离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿,根据用途不同形态各样,常用于细
胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml 、30ml 、15ml ;后者则多为10ml 和5ml 。
(6)其它:如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。
4、细胞培养温度
维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃1 小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1 小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42℃1 小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1 小时,细胞全部死亡。相反,温度不低于0℃时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢;放在4℃数小时后,再回到37℃培养,细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是,如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存。
5、合适的气体环境
气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH 是7.4-7.6。每种细胞都有其最适pH 值。
细胞培养无菌操作基本技术
无菌操作技术分为三个部分:工作环境及表面的处理,细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。
工作环境的处理
使用层流超净工作台是最经济有效的手段。超净工作台正常工作时,向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。
(1)实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60 分钟灭菌,用70% 酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10 分钟后,才可开始实验操作。每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染。实验结束后,将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验,则用70% 酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10 分钟后,才可进行下一个实验操作。
(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。
(3)小心取出无菌实验用品,避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,用手夾住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。
(4)工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。操作过程中,
应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐物品伤人等。
(5)定期检查下列项目:CO2 钢瓶内的CO2 压力;CO2 培养箱内的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染;无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管及HEPA 过滤器滤膜,预滤网﹙300 小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。
细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒
清洗
在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物,上次细胞残留物及非营养成分的化学物质,均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗,且要根据器皿的组成材料不同,选择不同的清洗方法。 玻璃器皿的清洗
组织细胞培养中,使用量最大的是玻璃器皿,故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹,而且不能残留任何物质。
(1)浸泡:初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿,在生产及运输过程中,玻璃表面带有大量的干固的灰尘,且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗,然后用稀盐酸液浸泡过夜,以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质,干固后不易洗掉,故用后要立即浸入水中,且要求完全浸入,不能留有气泡或浮在液面上。
(2)刷洗:浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗,以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度,过度会损害器皿表面光泽度。
(3)浸酸:清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成,其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用,而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液,勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜,不应少于6 小时。清洁液可根据需要,配制成不同的强度,常用的下列三种:重铬酸钾(g )浓
硫酸(ml )蒸馏水(ml )比例如下
(A )强清洁液 63∶1000∶200000
(B )次强清洗液 120∶200∶1000
(C )弱清洁液 100∶100∶100。
清洁液配制时应注意安全,须穿戴耐酸手套和围裙,并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中,然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌,使产生的热量挥发,配制过程中可使重铬酸钾溶于水中,然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌,使产生的热量挥发,配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。
(4)冲洗:玻璃器皿在使用后,刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作,则需流水冲洗十次以上,每天水须灌满及倒干净,最好用蒸馏水清洗3-5 次,晾干备用。
胶塞的清洗
细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质,应先用自来水冲洗,再做常规处理,常规清洗方法是:每次用后立即置入水中浸泡,然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟,以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后,再用1%稀盐酸浸泡30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20 分钟,晾干备用。
塑料制品的清洗
塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装,打开包装即可用,多为一次性物品。必要时用2% NaOH 浸泡过夜,用自来水充分冲洗,再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟,最后用自来水和蒸馏水冲洗干净,晾干备用。
消毒
细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌,真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起,常见的原因有操作间或周围空间的不洁,培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底。由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败,故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规,防止发生污染。
消毒方法分为三类:物理灭菌法(紫外线、湿热、干烤、过滤等),化学灭菌法(各种化学消毒剂)和抗生素。
(1)紫外线消毒:用于空气,操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好,经一定的时间照射后,可以消灭空气中大部分细菌,培养室紫外线灯应距地面不超过2.5 米,且消毒进物品不宜相互遮档,照射不到的地方起不到消毒作用。紫外线可产生臭氧,污染空气,试剂及培养液都有不良影响,对人皮肤也有伤害,不宜近照射。
(2)温热消毒:即高压蒸气消毒,是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时,消毒物品不能装得过满,以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险,保证其内气体的流通。在加热升压之前,先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气,冷气空气排出后,关闭排气阀门,同时检验安全阀活动自如,继后开始升压,当达到所需压力时,开始记算消毒时间。
消毒过程中,操作者不能离开工作岗位,要定时检查压力及安全,防止消毒及表皮意外事件发生。
常用物品消毒压力及时间:
培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体:121℃, 15 磅, 20 分钟;布类、玻璃制品、金属器械等物品:先121℃, 15 磅, 20 分钟,然后在烘箱中烘干;玻璃瓶:干热灭菌170℃, 4 小时。
(3)化学消毒法:最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭,前者主要用于操作者的皮肤,操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。
(4)抗生素消毒:主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。
培养细胞的完全培养基由基础培养基(如MEM )和添加剂(如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子)组成,培养基的配方一直在改进,其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。
基础培养基
绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上,添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物,其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸,维生素的范围亦很广,另外常规含有无机盐和代谢添加剂(例如核苷酸)。MEM/F12 这两种培养基各取1/2,形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM ,现应用于快速生长的细胞,同MEM 含有相同的营养成分,但浓度高出2~4倍。选择某种培养基,应仔细了解成分表,应知道大多数情形培养基都有不足。例如,有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸,而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域,但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言,
则并非最佳选择,特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁,据报道也有神经毒效应。
在所有这些培养基中,谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度,这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培养基中这两种物质缺乏时)。MEM 与F12均要用5%的CO2来平衡,DMEM 含更高浓度的NaCO3,要用10%的CO2来平衡,当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的,但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。
原则上,HEPES 作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐,以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然,溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长,该培养基采用了与众不同的BSS 作基础,它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力,培养基中使用半乳糖作碳源,以阻止培养基中乳酸形成,少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的,特别是在保持较高CO2有困难时,例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元,但尚未在CNS 神经元的发育研究中全面检测过。
血清
细胞在单纯的基础培养基中不能存活,在特殊类型的细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清,血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定,广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子,常选其作增殖细胞用的血清,也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而,很多人也将胎牛血清用于神经元培养,也有人用马血清来培养胶质细胞。用大鼠进行神经元培养的某些研究者喜欢使用同型血清;人类的胎盘血清,亦曾用于神经组织的器官类型的培养,也用在一些特殊培养种类中。
血清的不同批号含有不同的成分,所以许多人发现,应该在使用前对血清进行测试。大多数试剂商提供样品,所满意的批号即可选用,这样可以一次得到足够一年用量的血清,血清在使用前通常在56℃加热30分钟,这一过程称为灭活。
无血清培养基
1979年神经细胞培养出现了一个重要进展,用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的组合置换培养基中的成分,最后找到了适合大多数细胞培养的试剂配方,该配方称为N2,专门用于神经细胞培养,最早是用在B104大鼠神经母细胞瘤细胞系的培养。它的基础培养基是1:1的DMEM 与H12的混合液,添加了胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、腐胺和硒。胰岛素和胰岛素样生长因子对于大多数类型细胞的存活和生长有重要作用,硒是谷胱甘肽产生的合作因子,可能有助于过氧化物和超氧化物的水解,有报道说还能防止细胞的光照损伤。随后的其他配方如N1N3则含有较低浓度的转铁蛋白。
未料到的是上述配方构成的培养基可以支持神经母细胞瘤细胞系快速增殖,随后又发展了能
支持原代培养的各种神经元生长的培养基,这种培养基在许多实验室里已取代了有血清培养。在某些培养方案中,细胞直接进入无血清培养,这样的培养基可以消除来自血清的不均一性。更为重要的是,它们可用来检测生长因子以及其他促进神经元存活或生长的因子,或者用来检测那些可保护神经元免遭环境毒物损伤的制剂。专用于神经元的培养基在某些培养环境中还可以减低非神经元细胞的增殖,故可使神经元纯化。
血清中含有的组分,例如血清蛋白,可作为代谢毒物清除剂使用并能聚集于培养基中。当缺乏这些成分时,如神经元在无血清培养基中生长时,特别容易为过氧化物及自由基伤害,这已被许多研究者注意到了。过氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培养基中过氧化物和超氧化物的累积,有报道讲可以促进低密度培养细胞的存活。有学者发现细胞存活可为氧分压的下降而促进。因而,无血清培养基的配方常含有抗氧化剂的试剂。例如,维生素E 和丙酮酸,可作为过氧化物清除剂使用。上述这些影响在高密度培养时变小,特别是神经元与胶质共培养时,它们可以吸收和代谢神经元毒性物质如谷氨酸。
应该注意,尽管无血清培养基是有化学限定性的,但在培养过程中它仍有变动,培养起始时可能有些物质缺乏,而后细胞的产物可能积累,从而使培养基的成分改变。这其实是有另一方面的好处,即条件培养基(已培养过细胞的培养基)的形成,条件培养基常常用来增加神经元和胶质细胞的发育。
生长因子绝大多数哺乳类胚胎神经元有严格的营养要求,若不能提供适宜的生长因子或合适的因子组分,将会使绝大多数神经元在体外培养的数天中死亡。解决这一问题有两条思路,一是让培养细胞提供自己的营养因子,二是在培养基中加入纯的生长因子。如果细胞混合物能在高密度时生长,所需的生长因子便会积累到可观的数值,尤其当培养基很少变化时。若某种细胞混合物生长时有很少的营养需求,可保持培养基在一段时间里不作任何变动,以使营养(生长)因子积累,而最后促使所需要的细胞类型能够生长。但是,这种对营养(生长)因子自身倚赖性亦有弊端,因为通常在混合细胞群体中细胞很难有同比例增殖,某些细胞会因生长条件的贫乏而受限制。另外,这种方法只能进行相当高密度的细胞培养。因为培养基的条件在细胞的较低密度时变的不够有效。不过某些时候纯化神经元群体的低密度培养可用条件培养基(经过了高密度培养)进行,或在胶质上生长的神经元所用过的培养基来支持。 满足神经元营养需求的第二条途径是向培养基中加入生长因子。通常用于组培的通用适宜因子是神经生长因子NGF 。不过,只有少数对这种蛋白质有反应的细胞类型的细胞才能生长。
许多PNS 类型的神经元在离体状态时表现出简单的营养需求,只需提供单一的营养因子就足以使其在低密度时增殖。例如,大鼠交感神经元仅需NGF 即能存活,在其生存期间,这些神经元可在严格局限条件下生长好几个月(即在无血清培养基中、或缺乏胶质细胞、或在化学限定基质上)。有证据表明NGF 是活体中交感神经元存活的生理调节因子。然而,交感神经元也对来自胶质细胞的神经营养因子(GDNF )有反应,还有NT3、LIF 与CNTF 也对其有作用。在不产生GDNF 或NT3的动物中,交感神经元会有损伤。在离体与活体营养需求之间的差别或许可以用在不同环境中NGF 含量和分布的不同来解释,培养中的NGF 弥散在整个环境中,而在活体内,大部分区域的含量是有限的。因此,NGF 的重要性在于其合适的浓度。尽管在大多数实验中已经习惯了营养因子的最大效应使用量,其他营养因子的协同效应在亚优剂量下更容易观察到。此外,高浓度的营养因子可使细胞更能抵抗毒剂以及其他压力。相应的,低浓度的营养因子可能用来检查表现型,例如对自由基或氨基酸的毒性刺激剂量的反应。有许多其他的PNS 培养系统只需单一营养因子就可使有实用价值的细胞保持在一定比例,广为人知的有雏鸡睫状自主神经节神经元和大鼠背根神经节感觉神经元。不过,这些
模型也有局限性。例如,培养中的睫状神经节的神经元加入CNTF 时,超过90%的神经元能存活一个很长时期,但并未有迹象表明它属于内源的靶细胞来源的营养因子,而是有争论的相关分子,GPA ,扮演了这一角色。大鼠背根神经节含有好几种细胞群体,其中小细胞群、包括nocioceptive cell,对NGF 有反应,但其他神经元,例如大细胞群中的proprioception 却对不同的神经营养因子有反应。因此,在大多条件下培养物的生长并不能忠实反映亲代群体的所有特性,这一问题在CNS 的细胞培养中特别突出,因为已有的经验表明,没有一种培养基能适合于所有类型及亚类的
神经细胞的生长。
现有的证据已表明,CNS 神经元的营养需求比PNS 的更复杂。对脊髓运动神经元与视网膜节细胞神经元的研究表明,这些神经元与外周神经元相比能对更为广泛的营养因子起反应。例如,至少发现了15种不同的分子可在离体条件下增加神经元的存活。而且,已观察到运动神经元与视网膜对任何单独的营养因子的存活反应,与PNS 中所观察到的典型反应相比,都要小得多。因此,大多数影响运动神经元及视网膜节细胞的营养因子仅仅只能支持神经元的亚群,而神经元的最佳存活要求诸多因子的结合。在视网膜节细胞的培养中,因子的最佳组合(如BDNF 、CNTF 、IGF 、bFGF )包括了来自不同生长因子家族的代表。这一结果的普遍性尚待进一步的证实,但敲除单一的营养因子基因之后,没有表现出对CNS 大多类群的神经元的存活产生太大影响,这一观察与上述的事实是一致的。现已知少突胶质细胞的长期存活也需要众多营养因子的相互作用。
抗生素
在细胞培养中最常用的抗生素是青霉素(常用浓度是25~100ui/ml)与链霉素(25~100μg/ml)。这两种抗生素常混合使用。在一些实验室里,它们常规加入所有的培养基中。庆大霉素(10~100μg/ml)通常有广谱抗菌效应,并具有溶液稳定性,故也被一些实验室使用,特别是当有低水平的污染存在时更是这样。以上这些试剂对霉菌与酵母菌的污染均无效。
尽管很多实验室在细胞系的培养基中常规加入抗生素作继代培养,但仍建议不要在原代培养中加入抗生素,其理由之一是获得的细胞是无菌的,原代培养时的细菌污染很少发生。其次,尽管认为抗生素对细胞代谢的影响可忽略,但最好避免使用它们,以免细胞生长环境的不稳定。最重要的是要意识到培养中主要污染物的类型,它们通常暗示了问题的来源。
抗有丝分裂剂
某些DNA 合成抑制剂对分裂细胞有毒,但对没有DNA 合成的细胞仅有轻微影响。由于神经元通常缺乏DNA 合成能力,因此对抗有丝分裂剂没有多大反应。这样的试剂常常用于神经元的培养,以消除或减少非神经元群体。若要杀死所有的非神经元细胞,可以先加入血清或生长因子来保证有高比例的非神经元细胞进行DNA 合成,此时再加入抗有丝分裂剂。但是,某些细胞在它的细胞周期的某些时相时对抗有丝分裂剂是不敏感的。不过,可以重复的将抗有丝分裂剂使用于增殖的细胞群体。在CNS 神经元的培养中抗有丝分裂剂常常在星形细胞形成单层后加入,此时,星形细胞由于接触抑制而终止了DNA 的合成(即细胞停止增殖),它们不会因抗有丝分裂剂的加入而死亡。原代培养中用这种方法阻止成纤维细胞的过度增殖是十分必要的。有两种抗有丝分裂剂常用于神经元的培养:Fluorodexyuridine ,是胸苷合成酶抑制剂,一般使用浓度为~10μM 。尿苷(10μM )也常使用,可阻止不分裂细胞的RNA
合成。另外,阿糖胞苷也常被使用,其使用浓度为5~50μM 。使用任何一种抗有丝分裂剂,都必须考虑它的神经原毒性,应该确定最低效应的使用浓度。阿糖胞苷在很低的浓度下,也会对某些种类的神经元有毒性,可以造成特定神经原的死亡。其他的抗有丝分裂剂尚未表现出这种毒性。
培养的保持
培养物是应该保持在孵箱中的。孵箱可以自动将O2与CO2混合很快达到培养基的设计要求,空气中的氧浓度比血液和脑脊液中要高得多。对于某些细胞的生长,包括神经原,应使氧含量处在一个较低的水平。可以用孵箱达到这个标准,但这样的孵箱并未广泛使用。
高湿度可避免培养皿中培养基的蒸发,保持孵箱中的湿度通常是在箱底部放上一大盆水,这水应该经常换,乘水容器应经常消毒以防霉菌生长。若孵箱曾被霉菌孢子严重污染过,那么要想完全去除污染则会非常困难。当培养物必须要长期保持在孵箱中时,应采用较少培养基的瓶、皿,且将盖子盖紧以避免蒸发,或采用相应的按比例供空气的孵箱。
温度的精确调节应定期检查,孵箱温度常设置为37℃或较低温度。细胞在低温时可有较长时间的忍耐限度,但当温度升至39℃时,几小时内即死亡。
维持培养物的最佳方案常常改变。例如培养胶质细胞时,要经常换液以使其增殖达到最大。而在培养某些神经原时,则要求尽可能少的换液,神经原在两次换液之间的条件下长的最好。大脑皮质的培养要求在不换液的情形下维持一个月以上。另一方面,象海马神经原那样的细胞,倚赖于条件培养基,若换液太频繁细胞就会衰退,此时,可采用1/3或1/2换液的方式。 组织(细胞)培养发展史年鉴
1878 Claude Bernard:
证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。
1885 Wilhelm Roux:
在一个生理溶液中维持一快鸡胚的活性并观察其发育,从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。
1887 Ross Harrison:
利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基,在体外培养青蛙神经嵴,维持其活性达数星期,并观察到了神经纤维的生长,从解决了神经纤维的来源问题。Ross Harrison被人称为细胞培养之父。 1910 Burrows:
率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.
1911 Lewis & Lewis:
由海水、血清、胚胎提取物和盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液,并观察到了单层细胞的有限生长。
1916 Rous & Jones:
开创使用胰酶来收获贴壁生长的细胞。
1923-1931 Carrel & Baker:
研制T 型培养瓶大规模培养细胞。
1927 Carrel & Rivera:
制造了第一个病毒疫苗:牛痘疫苗。
1933 Gey:
发明了转管培养细胞的技术。
1948 Fisher:
研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006,该培养液至今还在使用。 1952 Gey 和同事:
分离培养了Hela 细胞。
1952 Dulbecco:
发明了噬斑法,用长满的单层细胞检测病毒。
1954 Abercrombie:
观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。
1961 Hatflick & Moorhead:
显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。
1965 Ham:
配制了第一个无血清培养液。
1975 Kohler & Miltein:
成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。
怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件?
ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC 网页的Cells and hybridomas链接,输入细胞名称就可以搜索ATCC 的细胞数据库。
数据库中有每一种细胞的详细描述,包括细胞的来源,培养和冻存条件,以及相关文献等资料。
为什么大多数细胞培养需要用二氧化碳培养箱?
一般细胞培养液的pH 在7.0-7.4之间。由于碳酸盐pH 缓冲系统是一种生理pH 缓冲系统(它是人体血液中最重要的pH 缓冲系统),大多数培养液用它来保持稳定的pH 。用粉末配制培养液时,常常需要加入一定量的碳酸氢钠。
对大多数以碳酸盐作为pH 缓冲系统的培养液而言,以为了维持稳定的pH ,培养箱中的二氧化碳需要维持在2-10%之间,以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气,以便于气体的交换。
是不是采用其他pH 缓冲系统就不需要二氧化碳培养箱了呢?人们发现由于空气中的二氧化碳浓度很低,如果细胞不在二氧化碳培养箱中培养,培养液中的HCO3-会被耗尽,这样会影响细胞的正常生长。所以大部分动物细胞的培养,还是需要二氧化碳培养箱。
细胞培养液中常附加其他的pH 缓冲系统,比如HEPES 缓冲系统,来增加pH 缓冲能力。HEPES 在pH7.2-7.4之间有很强的缓冲能力,当透气的培养器皿被拿到二氧化碳培养箱外面的时候,由于空气中二氧化碳浓度很低,培养液中碳酸盐缓冲系统就会失去效果,这时候HEPES 缓冲系统就能继续保持pH 的稳定。
为什么培养的细胞要及时传代?
体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性,也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候,它就会停止生长。当细胞铺满培养器皿的表面时,正常的细胞停止生长,但是转化(即发生遗传物质突变)的对接触抑制不敏感的细胞会继续生长。如果不及时传代,这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞。
二氧化碳培养箱的挑选和使用
由于动物细胞培养液一般使用碳酸盐pH 缓冲系统,要求培养环境中维持一定浓度的CO2,所以动物细胞的培养一般需要CO2培养箱。
CO2培养箱采用两种不同的CO2维持系统。一种方式是通过使用空气泵,将CO2和空气按一定比例混合后吹入培养箱。另一种方式是通过一个自动的CO2检测控制系统,在检
测到CO2浓度低于要求浓度时打开CO2气阀充入CO2。由于前一种方法耗费CO2而且不容易精确控制CO2浓度,先进的CO2培养箱都采用自动监控系统来维持CO2的浓度。
配有自动CO2检测控制系统的培养箱需要根据生产厂家的说明,定期做CO2浓度的测试和矫正。
CO2培养箱的隔热采用水套式和气套式两种类型。水套式需要用户在安装培养箱时培养箱壁的空间内灌入大量蒸馏水。由于水的比热容很高,水套式的优点是有助于均匀散热和避免形成冷区,以及在断电后能够比较好的减缓培养箱内温度的降低。它的缺点是由于灌入大量的水,培养箱变得非常沉重,不易搬动。有效的隔热系统和先进的表面散热元件的使用使气套式培养箱兼备了轻便性和水套式培养箱的优点,所以新型的CO2培养箱大多采用气套式。
目前大多数实验室都使用进口的细胞培养箱。虽然进口的产品质量上比较有保障,但价格很贵,而且售后服务不是很方便。国内的细胞培养箱的质量也有了很大的提高,比如笔者使用的长沙长锦科技有限公司的二氧化碳培养箱,在很多方面都接近笔者使用过的FORMA 二氧化碳培养箱,售后服务也比较好。
CO2培养箱一般配一个水盘,用以维持很高的湿度。水盘内的水要定期添加,水盘也要定期清洗以避免微生物的生长。
为了减少微生物的污染,有一些CO2培养箱提供灭菌功能。有的可以加热到比较高的温度来灭菌,有的则通过让空气循环通过一个紫外线腔体的办法来灭菌,这样就灭菌时就不需要中断细胞的培养。
超净台的挑选和使用
为了避免污染,一般的细胞培养需要在超净台上进行。用于细胞培养的超净台的洁净度一般为100级,即每立方英尺中大于0.5um 的颗粒数量少于100颗,与计算机硬盘的生产环境要求相当。
在超净台内,过滤后的空气垂直由上到下,或水平由内到外稳定的流动,从而维持一个洁净的操作环境。根据气流的方向,超净台可分为垂直式层流和水平式层流两种类型。 在水平式层流型超净台内,过滤后的空气由内到外流动,在操作过程中比垂直式层流型更容易维持一个洁净的环境,减少污染的机会。但是由于气流吹向实验操作者,增加了实验操作者感染病原体的机会,所以大部分实验室都采用垂直式层流型的超净台。
在普通的垂直式层流型的超净台内,过滤后的空气自上往下流动,通过操作面板前后两排开孔直接排出。这样的超净台比较便宜,但是不适合病原体相关的实验操作。相关病原体的操作必须要在生物安全柜内进行。在生物安全柜内,自上而下的过滤后的空气经过超净台,然后再次过滤后,才被排到外面,从而大大减少了病原体扩散的机会。当然生物安全柜比较贵,但考虑到培养的细胞中以及血清中都有可能有病毒等病原体的存在,有条件的实验室应该尽量使用生物安全柜来进行细胞培养。
超净台需要定期检查,超净台的空气过滤系统也需要定期更换,以保证超净台内的洁净度。空气过滤系统的更换次数可以询问生产厂家。如果有洁净度检测设备的话,可以非常迅速的检验超净台的洁净度。如果怀疑细胞培养过程中的污染是由于超净台内洁净度降低引起的,可以用将一个含微生物培养基的培养皿在超净台内敞口放置一段时间,然后在37℃培养的方法来评估。
超净台内一般都有紫外线灯用于灭菌。紫外线灯的正确使用方法是在超净台使用前打开半小时左右。有的操作人员在不使用超净台的时候把紫外线灯一直打开,这样不但没有必要,而且会大大缩短紫外线灯的使用寿命。紫外线灯要根据生产厂家的说明定期更换。
超净台使用完之后要先用蒸馏水擦拭,然后再用70%酒精擦拭。直接用70%酒精擦拭溅在台面上的培养液会在不锈钢台面上留下难以去除的污渍。
细胞培养中流行的错误(过时)知识
1 血清一定需要加热灭活
人们通常通过在56°C 加热30分钟的办法,来灭活血清中的补体,以及其中可能的微生物(比如支原体)的污染。加热灭活带来的问题是,血清中的氨基酸、维生素和生长因子等也会不同程度的被破坏。
Triglia and Linscott 的研究发现(1),胎牛血清中的补体含量很低,即使在未稀释的胎牛血清中,也观察不到溶血现象。另外37°C 的加热能够有效灭活补体。所以对胎牛血清而言,并不需要通过专门的热灭活来灭活其中的补体。
早期的血清制备中的滤膜的孔径大于0.22um ,不能有效的去除支原体的污染。热灭活可以去除支原体的污染。但是现在血清制备中的终端滤膜的孔径为0.1um 甚至小到0.04um ,所以血清中一般没有支原体的污染。
综合上面的观点,除非有特别的情况,标准厂家生产的胎牛血清一般不需要加热灭活。 需要说明的是,有些厂家生产的胎牛血清质量并不符合标准。笔者曾购买过国内一厂家的胎牛血清,没有灭活时细胞生长状态明显变差。所以如果您的胎牛血清来自一家可信度不高的厂家,那么为了安全起见,还是以加热灭活为好。
2 培养液中一定要加抗生素
随着超净台技术的提高,和超净台在细胞培养中的广泛使用,在细胞培养过程中如果操作规范,引进污染的机会并不大。同时抗生素的使用大大增加了支原体等微生物污染的机会,所以普通的细胞培养,最好不要加抗生素。
3 细胞培养室要异常的洁净
由于以前超净台技术比较差,在超净台开启的时候,外面的灰尘可能飘到超净台里,笔者曾经见过的一个老式的没有空气过滤装置超净台,仅使用紫外线灯灭菌,这样实验室的清洁就显得很重要。现代的超净台从原理上来说,超净台外的污染源是很难到达超净台里面的。所以保持细胞培养室一定程度的清洁固然有助于减少污染的机会,但是过度的清洁,比如用0.2%新洁尔灭拖地板,或者在培养室内加紫外线灯消毒,并不需要,更重要的是实验操作的规范。笔者曾经工作过的一个细胞培养室,维护实验室清洁的工作就是每天拖一次地板,每天大家进出并不换鞋换衣服,在2年多的时间内从没有发生过任何污染。
4 在超净台上使用酒精灯
事实上使用酒精灯会造成空气对流,从而带起超净台面上的灰尘,反而增加污染的机会。更何况还增加了火灾的隐患。