0脂肽类生物表面活性剂的研究进展_吕应年

DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2004.06.003

生物技术通报

　BULLETIN　　　　　　　　2004年第6期

·综述与专论·　　　　　　　　　BIOTECHNOLOGY

脂肽类生物表面活性剂的研究进展

吕应年　杨世忠　牟伯中

(华东理工大学化学系,上海　200237)

摘　要:　脂肽是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性的生物表面活性剂,在医药、食品、化妆品和微生物采油等方面有良好的应用潜力。本文对脂肽的生产、分离、鉴定及应用方面进行了综述。

关键词:　微生物　代谢产物　脂肽　生物表面活性剂

ProgressofLipopeptideBiosurfactants

LvYingnian　YangShizhong　MuBozhong

(DepartmentofChemistry,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai　200237)

Abstract:　Thelipopeptidetypicallysynthesizedbymicroorganismswhichisanimportantkindofbiosurfactants,andithasagreatpotentialinpharmaceutics,foods,cosmetic,oilrecoveryandmanyotherfields.Thispaperreviewslipopeptide-producing,isolationandidentificationofthelipopeptideanditsapplications.

Keywords:　Microorganism　Metabolite　Lipopeptide　Biosurfactant

　　脂肽类生物表面活性剂一般是革兰氏阳性的芽孢杆菌的代谢物。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成[1],由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构,脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前景,已成为研究开发的热点。目前发现的脂肽类生物表面活性已有十多种,主要包括Surfactin、Lichenysin、Iturin、Fengysin等。本文介绍和分析了脂肽类生物表面活性剂的生产菌株与脂肽的分离纯化和结构鉴定及应用前景,希望能有助于脂肽类生物表面活性剂的进一步研究与开发。

[2]

类生物表面活性剂,代表性的有Surfactin和Iturin。表1列出了几种主要的生物表面活性剂生产菌株及其产生的脂肽名称。

表1　脂肽类表面活性剂的生产菌株

生产菌株

BacilluslicheniformisBNP29Bacillussubtilis

Bacillus.subtilisATCC21332

生物表面活性剂

Surfactin,IturinAandFengycin

LichenysinAIturinASurfactin

Bacircines(BI)2,3,4,5and5A

Bacilluspumilus

Bacillus.amyloliquefaciensstrainB94

IturinA

SurfactinIsoformshomologoussurfactinSurfactinLiposanLipopeptide

FengycinTensinBacircineHalobacillinIsohalobacillinLichenysinALichenysinGDaitocidinPumilacidin

Bacillus.subtilisOKB105,BacillusnattoKMD2311Bacillus.subtilisIAM1213CandidalipolyticaCandidapetrophilumBacillusglobigii

Pseudomonasfluorescensstrain96.578

1　脂肽类表面活性剂的生产菌株

自然界中有多种微生物能通过代谢产生表面活性物质,酵母菌、真菌、细菌等都可以产生表面活性剂,主要是假单胞菌(Pseudomonassp.)、芽孢

杆菌(Bacillussp.)、节杆菌(Arthrobactersp.)、分支杆菌(Mycobacteriumsp.)和丁酸梭菌(Clostridi-umtyrobutyricum)等。其中,研究的最多的是假单胞菌和革兰氏阳性的芽孢杆菌。前者主要产生糖脂类生物表面活性剂如鼠李糖脂;后者主要产生脂肽

[3～4]

Bacillus.pumilus(marine)Bacillussp.CND-914,Bacillussp.A1238

Bacillus.licheniformisBAS50Bacillus.licheniformisIM1307

Bacillussp.Q-55Bacillus.pumilus937-B1

国家自然科学基金(59974014),高等学校博士学科点专项科研基金([1**********])教育部重点项目(03071)和上海市教委资助。

作者简介:吕应年(1975-),男,湖北应城人,硕士研究生,主要从事生物表面活性剂研究。:--64252063,E.cn

　　　　　　　　　　　　　　生物技术通报Biotechnology　Bulletin　　　　　　　2004年第6期122　脂肽类表面活性剂的结构

脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基,脂肪烃链形成亲油基。其中,亲水的氨基酸能和烃链上的羧基、羟基或氨基结合形成环状,因此,脂肽类生物表面活性剂一般是以内酯或酰胺键结合而成的环状脂肽(cycliclipopeptide)。如枯草芽孢杆菌产生的

和肽以酰胺键结合[5]。多数细菌代谢产生的脂肽的是七元肽,即脂肽分子中的肽链含有七个氨基酸;脂肪链中的碳原子数一般在12～17个之间。由于肽链中氨基酸的个数、种类及连接顺序的不同,同一株细

菌在相同培养条件下代谢产生的脂肽往往是多个结构异构体的混合物,而且脂肪链中碳原子个数及支链

脂肽类生物表面活性剂Surfactin和Iturin,前者是β-的位置不同,也会导致形成更多的脂肽同系物。图1羟基脂肪酸和肽以内酯键结合,后者是β-胺基脂肪酸是几种常见脂肽分子的结构图

。

图1　几种脂肽的基本结构

2004年第6期

　　　　　　　　吕应年等:脂肽类生物表面活性剂的研究进展13

　　不同的细菌能产生不同种类的表面活性剂,

枯草芽孢杆菌产生脂肽类生物表面活性剂,而铜绿假单胞菌能产生鼠李糖脂表面活性剂。同一种细菌的

不同菌株也能产生几种不同的表面活性剂[6～8],如枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生Surfactin,某些菌株能够同时产生Surfactin、Iturin、Fengycin。而且,即使同一种菌株产生的同一种表面活性剂,也不是纯的单一分子化合物,枯草芽孢杆菌产生的Sur-factin具有多个结构类似物。这些类似物具有Sur-factin的基本结构(如图2),7个氨基酸联接成肽链,与羟基脂肪酸以内酯键结合成环状,结构上的差别

在于几个位置的氨基酸被其它氨基酸取代。容易被取代的位置一般是7-,4-,2-的氨基酸。同时,碳链的长度及支链位置也不相同。已经分离发现的Sur-factin结构类似物有十多种(见表2),对这些Sur-factin的结构类似物,用常规的分离仪器往往难以完全分离和鉴定。目前,已经采用特殊分离柱的RP-HPLC分离结构差别微小的脂肽,用NMR、TOF-MS等确定脂肽的分子结构[9]。但是这种分离还只能满足分析用的微量样品,大规模的工业分离还处于实验研究阶段。

图2　Surfactin的基本结构

表2　Surfactin的异构体

序号12345

6789101112

氨基酸[Leu7]-[Val7]-[Ile2,Val7]-[Leu7]-[Val7]-[Ile2,Val7]-[Leu7]-[Ile7]-[Val7]-[Ile2,Val7]-[Ile7]-[Ile2,Ile7]-分子量[***********][***********]2210361036

脂肪酸碳链长

C13C13C13C14C14C14C15C14C15C15C15C15

碳链类型anteisoanteison.d.isoiso/nisoanteisoisoanteisoanteisoanteison.d

碳链的碳原子个数及支链位置不同;而且,Surfactin分子的肽键是一种马鞍型的立体结构[16],这种特殊的结构对于理解Surfactin的阳离子键合和转移能

力是有益的。Nathalie[17]利用高能串连质谱分析了Surfactin的结构。高学文[18]等利用MALDI-TOF-MS质谱技术研究了Surfactin的异构体,我们应用电喷雾离子化质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS-MS)鉴定了Surfactin类似物的分子结构[19]。

3　脂肽类生物表面活性剂的制备与生产

细菌代谢产生脂肽类生物表面活性剂的过程中,培养条件对表面活性剂的产量有直接影响。一般考虑的主要影响因素有培养基的离子浓度、培养温度、营养底物以及生产发酵的工艺。3.1　离子浓度对产量的影响

研究表明,培养基中Fe2+、Mn2+浓度对表面活性剂的产量有显著的影响[20,21]。在枯草芽孢杆菌生产Surfactin的实验中,向培养基中加入不同浓度的硫酸亚铁得到的Surfactin产量不同,1.7mM时,脂肽的分离和鉴定依赖于分离方法和分析手段的进步。自1968年分离得到表面活性素Surfactin以来

[10]

,人们采用更先进的分析方法和仪器认识了

Surfactin及其结构类似物的分子特征[11～12]。确定结构的检测手段主要有光谱法、化学修饰、质谱技术和二维核磁共振技术等[13～15]。研究发现,Surfactin

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葡萄糖培养基中Mn2+浓度为0.01mM时Surfactin的产量可达到2.6g/L,比一般0.33g/L的产量增加9倍。3.2　营养底物对产量的影响

传统方法用烃做碳源培养细菌生产生物表面活性剂,若用葡萄糖做碳源则生产成本过高。为此,人们尝试用其他替代品如城市生活垃圾、工业废物等廉价材料生产表面活性剂。糖蜜作为工业副产品可以作为生产表面活性剂的碳源。用土豆废液做碳源培养枯草芽孢杆菌生产Surfactin,不需要经过灭菌即可用于生产,产量比纯土豆淀粉培养基低60%,这种廉价原料可以使它应用于生物治理污染和微生物采油。3.3　生产工艺对产量的影响

传统的生产工艺是采用发酵罐培养细菌生产表面活性剂。研究表明,用麦麸做原料制成填充柱反应器使枯草芽孢杆菌产生表面活性剂。该研究结果表明填充柱式反应器可以作为生产生物表面活性剂的固相反应体系应用于商业领域。泡沫分馏法可用于从发酵液中回收Surfactin,因为含有细菌的发酵液比无细菌的发酵液产生的泡沫更稳定,因此提取效率更高。发酵过程中低搅拌速度对产生泡沫是必要的,发酵10～30小时,搅拌速度166～146rpm能得到高浓度的Surfactin泡沫流出物,浓度在1.22g/L～1.67g/L,这个方法可以应用在完整的生产回收工艺中[25]。

[24]

[23]

[22]

Surfactin作为表面活性剂能与病毒的脂质膜发生物理化学交互作用。Surfactin的病毒灭活作用可以使它能够应用于增强生物技术的病毒安全性方面;而

且,由于Surfactin的异构体具有体内毒性低的优点,使得在制药工业中生产的药品用此类试剂后不再需要除去病毒灭活剂[26]。进一步的研究发现,Surfactin的抗病毒活性取决于疏水基的碳原子数目和肽键的电荷[27],疏水基烃链的碳原子数为C13的抗病毒活性比C14和C15低许多,C15的单甲酯有灭活SFV病毒的活性,这种病毒对枯草芽孢杆菌产生的Surfactin混合物具有抵抗力,比较而言二甲酯没有抗病毒活性。C15的异构体及带负电表现出最高抗病毒活性。

4.2　用于防治植物病原菌

抗生素类Iturin具有广谱抑制植物病原菌的作用。用大豆残渣固体培养发酵得到的Iturin产量是液体培养的10倍,此培养液能有效抑制西红柿的丝核菌。实验表明,Iturin能够作为生物控制剂取代化学杀虫剂,使得食品工业的有机废料经细菌转化成具有生物杀虫剂作用的有机废料,有效地实现了有机废物循环利用。不同的枯草芽孢杆菌株还能产生杆菌抗霉素类似物,也具有强烈的抗真菌活性[28]。

4.3　除去受污染土壤中的重金属离子

脂肽生物表面活性剂能选择性除去土壤中的Pb,Zn,Cu,和Cd等重金属离子[29]。其中,Cu最易被除去,而且,NaOH或Na2CO3对于Cu的除去有重要影响。能够除去重金属离子的原因在于他们带有负电荷,能结合带正电的金属阳离子。由地衣芽孢杆菌产生的脂肽地衣素能够和阳离子螯和[30],且地衣素是比表活素更稳定的阳离子螯合剂,Lichenysin-Ca复合物的个数比是2∶1,即一个

2+

Ca能结合两个地衣素分子,而Surfactin的结合比是1∶1。

4.4　降解有害农药

在农药污染的土壤中添加脂肽生物表面活性剂或培养表面活性剂产生菌,能显著降解有害成分。在土壤中添加生物表面活性剂降解硫丹杀虫剂,可以使降解率提高30～45%[31]

2+

4　脂肽类生物表面活性剂的应用

生物表面活性剂的表面活性与化学合成的表面活性剂相当,但具有可生物降解的优点,因而不会造成环境危害。生物表面活性剂在多种领域内有着广

泛应用前景,可用于食品、化妆品、医药以及微生物采油等行业,但是由于目前生物表面活性剂的生产成本较高,大规模的应用还有待进一步研究降低生产成本,纯的生物表面活性剂目前多用于科学研究为目的。

4.1　抗病毒作用

在研究surfactin对脂包膜病毒的灭活机理时发现,Surfactin灭活病毒遵循两阶段灭活动力学,对脂包膜病毒比非脂包膜病毒灭活效率高,尤其是疱疹。

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Surfactin在水溶液中能形成稳定的泡沫[32],当Surfacin浓度从0.05增加到0.2mg/ml发泡体积几乎不变,形成的泡沫比BSA(牛血清白蛋白)更加均匀细腻。而且加入BSA后Surfactin的发泡产生协

同增效作用。脂肽表面活性剂的脂基和肽基结构对于发泡性能有影响。碳链数为14个碳原子时发泡性能最好。碳数增加到15以上泡沫体积急剧减少,C13的乳化性能好而另两者的发泡性能好。碳数相同时,Surfactin能产生更细腻的泡沫而Iturin产生的泡沫稳定性更好,表明肽结构对于发泡性能有重要影响。4.6　微生物采油

生物表面活性剂可促进原油从矿石、含有页岩断层的表面解吸附。解吸附的范围和大分子量烃的浓度相反。而且表面活性剂复合物还能够促进原油降解[34,35]。微生物在油井内利用烃为碳源生长繁殖,能够产生表面活性剂、产酸、产气、产多聚物,从而促进原油从地底采初。表面活性剂对长链烃的降解更显著,栳鲛烷和植烷类异戊二烯的降解程度和C17、C18烃的降解一样。

[33]

5　AhimouaF,JacquesbP,DeleuaM.EnzymeandMicrobialTech-nology,2000,27:749～754.

6　MichailMY,Wolf-RainerA,etal.BiochimicaetBiophysicaActa,

1999,1438:273～280.

7　BruceH,WilliamsYH,etal.JMassSpectrom,2002,37:259～

264.

8　JacquesP,HbidC,DestainJ,etal.ApplBiochem.Biotechnol,

1999:223～233.

9　LinSC,ChenYC,LinYM.JChromatogrA,1998,825(2):149

～159.

10　ArimaK,KakinumaA,TamuraG.BiochemBiophysResCom-mun,1968,1:488～494.

11　KowallM,VaterJ,KlugeB,etal.JColloidInterfaceSci,1998,

204(1):1～8.

12　ChenYC,LinYM,LinSC.XingdaGongchengXuebao,1999,

10(1):25～33.

13　BaumgartF,KlugeB,etal.BiochemBiophysResCommun,

1991,177:998～1005.

14　GrangemardI,PeypouxF,WallachJ,etal.JPeptideSci,1997,

3:145～154.

15　GrangemardI,BonmatinJM,etal.JAntibiotics,1999,52:363

～373.

16　HorowitzS,GriffinWM.JIndMicrobiol,1991,7:45～52.17　NathalieH,LaurentS,OlivierL.RapidCommun.MassSpec-trom,2001,15(3):203～209.

18　高学文,姚仕义,等.微生物学报,2003,43(5):647～652.19　杨世忠,牟伯中,吕应年,等.化学学报,2004,62(19)(已接

受).

20　WeiYH,ChuIM.EnzymeMicrobTechnol,1998,22(8):724

～728.

21　WeiYH,ChuIM.BiotechnologyLetters,2002,24(6):479～

482.

22　MakkarRS,CameotraSS.JAmOilChemSoc,1997,74(7):

887～889.

23　ThompsonDN,FoxSL,BalaGA.ApplBiochemBiotechnol,

2001,487～501.

24　VeenanadigNK,GowthamanMK,KaranthNK.BioprocessEng,

2000,22(2):95～99.

25　DavisDA,LynchHC,VarleyJ.EnzymeMicrobTechnol,2001,

28(4～5):346～354.

26　VollenbroichD,OzelM,etal.Biologicals,1997,25(3):289～

297.

27　KrachtM,RokosH,OzelM,etal.JAntibiot,1999,52(7):

613～619.

28　MoyneAL,ShelbyR,etal.JApplMicrobiol,2001,90(4):622

～629.

,5　展望

脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类重要化合物,由于其独特的两亲分子结构和生物来源,使它们在研究应用方面受到重视,在许多工业领域有应用前景。然而,由于其产量较低,生产成本较高,大规模的工业应用还未能实现。随着生物技术的不断进步和生物工程的发展,对脂肽类生物表面活性剂的研究不断深入,尤其是对产生菌株进行分子生物学的研究,有利于进一步认识脂肽的生产调控机制,进而通过构建基因工程菌和优化培养条件、改善分离工艺,人们能够在将来大规模应用具有商业价值的脂肽类物质。

参考文献

1　KosaricN,CairnsWL.BiosurfactantsandBiotechnology.NY:

MarcelDekkerInc,1987..

2　JitemdraDD,IbrahimMB.MicrobioMolBiolRev,1997,61(1):47

～64.

3　李祖义,施邑屏,李云江,等.工业微生物,2002,32(2):1～4.4　吕应年,杨世忠,牟伯中.微生物学杂志,2004,24(3)(已接

　　　　　　　　　　　　　　生物技术通报Biotechnology　Bulletin　　　　　　　2004年第6期16

(21):3812～3820.

30　GrangemardI,WallachJ,etal.ApplBiochemBiotechnol,2001,

90(3):199～210.

31　AwasthiN,KumarA,etal.JEnvironSciHealthPartB,1999,

B34(5):793～803.

32　RazafindralamboH,PaquotM,BanielA,etal.FoodHydrocol-loids,1997,11(1):59～62.

33　RazafindralamboH,PopineauY,etal.JAgricFoodChem,

1998,46(3):911～916.

34　IvshinaIB,KuyukinaMS,etal.WorldJMicrobiolBiotechnol,

1998,14(5):711～717.

35　MoranAC,OliveraN,etal.Biodegradation,2000,11(1):65～

71.

·国外动态·

光化学技术可望成为从烟道气中消除汞的有效技术

ChemicalEngineering2003年110卷2期15页报道:紫外光(UV)可能是一种从烧煤工厂的烟道气中排除汞的简单而有效的手段。最近,美国能源部国立能技术实验室(NETL,netl.doe.gov)的科学家进行的有关模拟排烟的实验室试验已证明,其除汞率高达70%。

由于253.7nm的UV在280～350°F下用于辐照排烟,故此种工艺已被定为GP-254。NETL的一位化学工程师EvanGranite阐明,由于UV可使汞与排烟中的其他成分发生反应,从而形成硫酸亚汞和氧化亚汞,因而利用袋滤器或静电沉淀器可以截获上述化合物。

据悉,目前美国虽已对焚烧城市废物和有害废物的焚烧炉的排烟中的汞释放量有所规定,但对烧煤工厂的烟道气中释出的汞尚无限制。

Granite说:现今常利用活性炭(AC)来消除焚烧炉烟道气中的汞,这种排烟中的汞浓度高达100ppb以上。但他说:利用AC来消除烧煤工厂烟道气中的汞是不可行的。这是因为后者的汞浓度一般仅为约1ppb。初步测试证明,虽然UV设施的成本高于AC,但利用UV的工艺成本则要低得多。NETL从2003年春季开始在烧煤5001b/h的中间试验中,进一步检测利用UV从烧煤排烟中消除汞的效果。

美刊报道美国科学家坦克斯利和我国科学家袁隆平荣获沃尔夫农业奖

AgBiotechReporter2004年21卷3期18页报道:《康奈尔记事》宣布,美国康奈尔大学的科学家史蒂文·坦克斯利和中国国家杂交稻研究和开发中心的科学家袁隆平荣获2004年沃尔夫基金会农业奖。已知,以色列沃尔夫基金会为促进全球自然科学和艺术的发展,自1978年来每年都要把沃尔夫奖授予全世界在农业、化学、数学、医学和物理学以及艺术等诸领域内的杰出人士。沃尔夫奖的获得者,是由全世界各有关学术领域内的3名专家组成的国际委员会评选出来的。

指出:坦克斯利是一位“创造性地发展杂交稻,以及发现这种重要的粮食作物的杂交优势的遗传基础的科学家。”袁隆平既是“世界植物基因组研究的领导人之一”,也是“通过在野生祖先中鉴定出可显著提高水稻单产的基因,藉以阐明杂交优势的主要科学家。”

汪开治