BMP2活性肽纳米晶胶原基骨修复材料复合移植修复大鼠颅骨缺损的实验研究

华中科技大学

硕士学位论文

BMP-2活性肽/纳米晶胶原基骨修复材料复合移植修复大鼠颅骨

缺损的实验研究

姓名：贺永进

申请学位级别：硕士

专业：外科学（骨科）

指导教师：郭晓东

2011-04

BMP-2活性肽/纳米晶胶原基骨修复材料复合移植修复

大鼠颅骨缺损的实验研究

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科

硕士研究生：贺永进

指导教师：郭晓东 教授

摘要

【目的】探讨自行研发合成的BMP-2活性多肽与纳米晶胶原基骨修复材料复合移植促进大鼠颅骨缺损修复的有效性与实用性，并对比分析其与已商业化的rhBMP2生物学效应。

【方法】采用固相合成法合成BMP-2活性多肽P24，并与rhBMP-2分别通过冷冻干燥法真空吸附到nHAC 多孔支架材料上。动物实验分为四组。A 组：5mg P24/ nHAC复合材料；B 组：3µg rhBMP2/ nHAC复合材料：C 组：空白nHAC 材料；D 组：单纯缺损。取19只大白鼠随机分配到四组中，建立直径为5mm 的大鼠颅骨缺损模型，分别将材料植入颅骨缺损处，术后6周、12周分别处死各组动物，分别进行X 线、CT 三维扫描及组织学检查，并进行骨缺损修复面积测定，比较各组材料的成骨作用。

【结果】①6周X 线， A、B组骨缺损可见小片高密度影；C组骨缺损边缘有轻微高密度影；D组缺损无改变。12周X 线， A、B组骨缺损有大片高密度影，B组基本修复缺损；C组骨缺损高密度影有所增强，但未能修复；D组缺损边缘可见极少量高密度影。②CT三维重建：6周时A、B组可见部分高密度钙化影，断层面少许骨桥连接；C 组边缘少量成骨，断层面未见骨桥生成。12周时A 组骨缺损已大部修复；B组骨缺损已完全修复，断层面可见缺损由骨桥完全连接；C组周边有部分新骨形成，断层面骨桥未连接缺损；D组缺损未见明显成骨。骨缺损处高密度影测定，A、B组与C、D组相比均有极显著差异（p＜0.05），而A、B组成骨量则近似(p＞0.05)。③组织学检查：6周时A、B组可见少量新生骨组织和活跃的成骨细胞；C组材料少许降解，无明显炎症反应。12周时A、B组材料基本降解，有骨重建过程，但A 组成骨量少于B 组；C组缺损区有大量纤维结缔组织，有少量新生骨在材料周边发现。

【结论】①P24/ nHAC复合材料促进骨缺损修复能力明显强于空白的 nHAC，略低于3ug 剂量的 rhBMP2/ nHAC复合材料。②nHAC 是一种理想的生物支架和缓释材料。③P24/ nHAC复合材料是一种理想的具有稳定骨诱导活性的新型骨缺损修复材料。

【关键词】BMP-2活性多肽；颅骨缺损；纳米晶胶原基支架；骨诱导；骨组织工程。

Experimental Study of Repair of Cranial Bone Defects using

BMP-2 derived bioactive peptide combined with

nano-hydroxyapatite and Collagen I

Abstract

Objective: To investigate the osteogenetic capacity of bone repair in rat cranial bone defects by nHAC loading with a BMP-2-derived peptide P24 biomimetic scaffold materials.

Methods:19 male Sprague–Dawley rats were divided into four groups. Five-millimeter critical-size cranial bone defects were created in each one. The defects were treated with P24/nHAC scaffold (A group), rhBMP-2/ nHAC scaffold (B group), nHAC scaffold (C group)and only bone defect(D group). Up to the 6and 12th th weeks, the rats were sacrificed in batch respectively. Defects were evaluated by X-ray 、three-dimensional reconctruction of computer tomography 、histology and the percentage of bone formation areas.

Results: ①Radiological examination indicated that there were some flaky radiodense areas in A and B gruoups of each rat, but the density of the radiodense areas of C group were obviously lower than the density of A and B groups at the 6week.At the 12 week,the radiodense areas of C group were denser than the 6

th th th week,but defects not repaired. The defects nearly healed at the 12week in the A and B groups. A trifle of radiodense areas were discovered in the margin of defects in the

D group.②Three-dimensional reconstruction of computed tomography indicated that there were fewer radiodense areas and not saw bone bridge in the C group, but the density of the radiodense areas of A and B groups were obviously denser than the density of C group and bone brige was discovered at the 6week. The defects completely healed in B group and nearly reparied in A group that was treated with th

BMP-2- derived peptide loaded nHAC at the 12week ,while not saw defects were connected by bone bridge in C group and D group. The percentages of the regenerated areas in C and D group were significantly lower than A group and B group at 6 and 12 weeks (p＜0.05),but no significant difference between A group and

B group(p＞0.05). ③ Histological examination: At 6 weeks post-surgery, Small amount of composite in group C degraded, few of inflammation; and A group and B group showed some new bone tissue and osteoblasts. At 12 weeks, in the A group and

B group, the bony-union between new bone and host bone was observed. Meanwhile, the composite was almost completely degraded. In the C group, there were still slight amounts of new bone, the scaffolds were only partly degraded and the residual materials were surrounded by areas of new bone formation.

Conclusion:①The osteogenic capability of BMP-2- derived peptide loaded nHAC is obviously superior to nHAC alone.② nHAC is an ideal scaffold and a sustained release carrier.③It is suggested that P24/ n nHAC biomimetic scaffold material can be a ideal and steady repairing material for bone defects.

Key words: BMP-2-derived peptide;Cranial bone defects;nHAC; Bone induction ;Bone tissue engineering.

th

英文缩略词表（Abbreviations）

英文缩写

Col-I

nHAC

BMSC

BMP

BMP-2

P24

TGF-β 英文全称 type I collegen 中文全称 I 型胶原 nano-Hydroxyapatite/collegen纳米晶胶原骨支架材料 bone marrow stromal cells bone morphogenetic protein 骨髓基质干细胞 骨形态发生蛋白 bone morphogenetic protein-2骨形态发生蛋白-2 BMP-2 derived peptide BMP-2活性肽P24 transforming growth factor-β转化生长因子β

碱性磷酸酶

骨钙素 ALP alkaline phosphatase OCN osteocalcin

独创性声明

本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。

学位论文作者签名：

日期： 年 月 日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

保密□ ，在_____年解密后适用本授权书。

本论文属于

不保密□。

（请在以上方框内打“√” ）

学位论文作者签名： 指导教师签名：

日期： 年 月 日 日期： 年 月 日

BMP-2活性肽/纳米晶胶原基骨修复材料复合移植修复

大鼠颅骨缺损的实验研究

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科

硕士研究生：贺永进

指导教师：郭晓东 教授

前言

高能量创伤、骨肿瘤、骨髓炎所造成的大范围骨缺损的治疗问题长期以来困扰着骨科医生。据最新统计，我国每年因创伤骨折及各种骨病造成骨缺损患者高达600余万人，急需大量骨修复材料，骨移植已成为仅次于输血的需求量最大的移植物，而且有逐年增多的趋势。临床中对骨材料的大量需求已使被认为是骨缺损修复“金标准”的自体骨移植显得捉襟见肘且弊端众多[1-2]，已成为惊弓之鸟的现代人对同种异体骨潜在的疾病传播性和免疫排斥性等问题也是难以接受。因此研发一种具有非免疫源性、骨传导性、骨诱导活性和降解性的人工骨修复材料已成为目前的热点和趋势[3-4]。

骨形态发生蛋白（BMPs ）是β生长转化因子（β-TGF）超家族的一员，其为目前发现的唯一能诱导异位成骨的细胞因子家族，在骨的形成和修复中扮演着重要角色，其中BMP-2是研究最为广泛，同时也是公认的成骨活性最强的细胞因

、骨钙素（OCN）、钙含量被认为是细胞向成骨分化和子[5-6]。碱性磷酸酶（ALP）

矿化的三大标志，在先前的体外研究中已证明BMP-2能显著提升其表达[7-9]。但由于目前在国内外BMP-2多采用基因工程、分子生物学等技术生产，其制备过程复杂、生产量低下，难以大规模生产应用且价格昂贵；同时也存在着致癌、促进细胞凋亡等基因工程产品安全性问题。研究发现，BMP-2的成骨呈现出剂量依赖性，其半衰期在体内仅为7-16分钟[10]，直接放入缺损部位很快会被吸收和降解，因此要增加外源性BMP-2的使用次数和剂量，这样就大大增加了机体所吸收的毒性，也增加了患者的经济负担。因此，必须降低BMP-2的生产成本，减少其成骨以外的作用，并复合于一种体内的缓释系统，才能提高其利用的效率，切实的运用于临床，造福患者。

BMPs 蛋白的受体主要分为两型，即BMPRⅠ、BMPRⅡ，都是跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶受体，这两型的受体并不是BMP-2特异的，与其它BMP 蛋白，甚至其他TGF-β家族蛋白都有亲和活性。与以上两个受体结合的BMP-2的配体区域为“腕状表位”（wrist epitope）和“指端表位”（knuckle epitope）[11-12]。天然BMP-2由114个氨基酸残基构成，但形成能于受体结合的配体区域，发挥成骨作用的核心氨基酸只有20几个[10]。本实验组根据BMP-2氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区，设计出参与构成“指端表位”的一种含24个氨基酸的小分子多肽P24，其氨基酸序列不仅能于BMPRⅡ特异性结合，发挥成骨作用，而且其包含的磷酸化丝氨酸以及天冬氨酸能使多肽与材料结合后在局部形成磷酸基、羧基等阴离子活性基团，从而起到调控机体内生物自组装矿化的作用促进骨再生。 [13]。早期的体外细胞分化研究和体内异位成骨实验研究[14]证实P24具有稳定的生物学成骨活性，并呈时间和剂量依赖性。

一种优良的载体不仅仅能使通过材料吸收的BMP-2等活性因子起到缓释作用，同时还要具有适当孔隙的三维立体结构，优良的材料-细胞界面和稳定的力学强度支撑，才能更有利于细胞的粘附、增殖，促进成骨细胞的分化成熟，为新生骨的张入提供空间。大量的动物实验研究[15]证实，在良好的支架材料上负载成骨活性因子能有利于骨缺损的修复，也是骨组织工程发展的方向之一。本课题组与清华大学合作，引进一种新型仿生骨多孔材料，通过材料学自组装技术，以I 型胶原为模板，在溶液中诱导纳米羟基磷灰石延特定方向沉积，采用有机分子调控无机生长的方法制备纳米晶胶原基复合多孔框架材料[16]。为了检测该材料的成骨性能以及P24多肽的成骨稳定性、与rhBMP-2剂量关系，将该材料分别复合P24和rhBMP-2，以单纯空洞为对照组，分为四组分别修复大鼠颅骨缺损，观察三者的修复能力。

材料与方法

1.主要仪器和试剂

P24(上海吉尔生化有限公司)；

纳米晶胶原基骨修复支架材料（清华大学材料系）；

rhBMP2（PeproTech 公司，美国）；

倒置相差显微镜 (Olympus公司，日本) ；

CR 机(柯达公司，美国) ；

CT 机（SIEMENS,CS/QR720,德国）；

真空干燥箱（上海索谱仪器有限公司）；

真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；

环境扫描电镜（QUANTA200，FEI公司）；

固相肽链合成仪(Inc ABI, model 431A, Foster city公司)。

2.实验动物

6-8周SD 大鼠19只，二级清洁，雄性，体重250g±15g,健康，饲养于清洁级环境下（华中科技大学同济医学院动物中心提供）。

3.纳米晶胶原基骨修复支架材料的制备

首先将胶原溶于醋酸溶液中，充分搅拌，再缓慢滴加含钙离子溶液和含磷酸根离子的水溶液，同时滴加NaOH 溶液调pH 值为7.4，充分搅拌十小时以上，冰冻干燥后研磨制得干粉备用，将I 型胶原置于烧瓶中，加入溶剂，与干粉混合均匀，加入一定量的纳米羟基磷灰石粉末，充分搅拌后采用溶盐法或热致分相并冻干溶剂的方法制备纳米晶胶原基多孔支架材料。并制成直径为5mm ，厚度为2mm 圆柱状材料，环氧乙烷消毒，﹣20°冰箱保存备用（如图1）。

4.P24的合成

BMP-2活性肽，含有24个氨基酸，通过FMOC/tBu固相多肽合成法合成，肽链的连接在多肽自动合成仪上进行，纯化冻干后呈粉末状物质，色谱分析纯度在98.6%。

5.P24/纳米晶胶原基复合材料的制备

将50mgP24溶于5ml 的0.1%PBS溶液中，充分溶解，置入10枚圆柱体直径5mm 材料浸泡，送真空冷冻干燥机中(-55℃) 干燥48h ，消毒后置于-20℃冰箱

保存备用。

6. rhBMP-2/纳米晶胶原基复合材料的制备

将9ugrhBMP-2溶于5ml 的0.1%PBS溶液中，充分溶解，置入3枚圆柱体直径5mm 材料浸泡，送真空冷冻干燥机中(-55℃) 干燥48h ，消毒后置于-20℃冰箱保存备用。

7. 动物实验和方法

成年健康雄性SD 大鼠19只，随机分配到4组中，A 组植入5mg P24/ nHAC 复合材料；B 组植入3µg rhBMP2/ nHAC复合材料：C 组植入空白nHAC 材料；D 组为单纯缺损。2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒铺无菌巾，取大鼠颅骨正中纵行切口，逐层切开皮肤、皮下及骨膜，向两侧牵拉暴露顶骨，于颅骨正中缝和人字缝交叉的外下象限以牙钻钻出一直径约5mm 类圆形颅骨全层缺损，应避免损伤硬脑膜和矢状窦。分别将三种材料植入缺损处，生理盐水冲洗后缝合伤口（如图

2）。术后予以青霉素40万单位/天，连续3天。按6周和12周2个时间点，如表1示每组处死相应大鼠数进行放射学和组织性检测。

表1 大鼠颅骨缺损修复实验分组

组别 6周处死数 12周处死数

A 组 5只 5只

B 组 1只 2只

C 组 1只 2只

D 组 1只 2只

8.观察指标

(1) 一般情况:术后观察大鼠的饮食、活动等一般情况和手术伤口有无感染、咬破；另取材肉眼大体观察缺损的修复。

(2) 放射学检查:术后6周和12周每组取相应大鼠在同等条件下进行X 线、CT 三维重建和断层扫描。CT扫描参数：120KV，120mA，重建层厚0.75mm。三维重建用Image-Prop lus5.1图像处理软件进行高密度影占骨缺损面积百分比计算。

(3) 组织学观察:于6周、12周取出大鼠颅骨，4%多聚甲醛固定后，行EDTA 脱钙处理，经石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE) 染色。采用光镜观察新生骨情况

及材料降解情况。

9.统计学方法

应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析处理，所得数据均用均数±标准差( x ±s ) 表示,四组之间骨缺损处高密度影所占百分比均用配对t 检验方法进行比较。P

结 果

1.实验动物情况及标本大体观察

所有动物均成活，植入部位无流脓、坏死、破溃。

术后6周，C 组材料与周围组织界限清晰，植入材料少量降解，A 组、B 组植入区质地较硬，少量新骨形成，材料与周围组织界限仍分明，材料部分降解。术后12周，C组植入材料周边少量新生骨，但界限依然清晰与宿主骨结合不紧密，A 组、B组植入区新生骨形成增多，材料与缺损边缘结合紧密界限模糊，少量材料残留，骨痂桥接完全。D组仍为缺损空洞，少许软组织覆盖。见图3。

2.实验动物X 线观察

通过X 线观察（见图4），6周X 线，C组骨缺损边缘有轻微高密度影，A、B组骨缺损中间及周边可见小片较高高密度影，考虑为骨岛或矿化组织形成。12周X 线，C组骨缺损周边高密度影有所增强，应为爬行生长的新生骨，但未能修复缺损， A组骨缺损有大片高密度影，基本充满缺损部位，但密度较正常骨低，B 组骨缺损基本修复，骨桥连于缺损两端，缺损边线模糊。D 组在6,12周无修复，缺损周边极少高密度影。

3.实验动物CT 三维重建、断层扫描结果

6周时C 组边缘少量成骨，断层面未见骨桥生成，A组、B组可见部分高密度钙化影，断层面少许骨桥连接，D组空洞缺损无明显变化。12周时C 组周边有部分新骨形成，材料整体密度降低，断层面骨桥未连接缺损，A组骨缺损已大部修复，密度接近正常骨宿主骨，B组骨缺损已完全修复，密度与正常骨无异，断层面可见缺损由骨桥完全连接。D组缺损未见明显成骨。见图5、6。

术后6周和12周骨缺损处高密度影测定，A、B组与C、D组相比均有极显著差异（p＜0.05），而A、B组成骨量则近似(p＞0.05)。见图7。

图7 术后各实验点每组高密度影所占骨缺损区百分比( x ±s )

4.组织学观察

术后6周时C 组材料少许降解，无明显炎症反应，少量成骨细胞长入材料内部；A组、B组材料开始降解，可见少量新生骨组织和代谢旺盛的成骨细胞散在分布于材料孔洞内。D组宿主骨周边炎性反应，未见成骨细胞。

12周时C 组缺损区有大量纤维结缔组织，有少量新生骨在材料周边发现，材料部分残留；A组、B组材料基本降解，有骨重建过程，有少量编织骨，但B 组成骨量少于C 组。D未见明显成骨，在宿主骨周边可见疤痕样结缔组织。见图8。

讨 论

1965年，Urist首次用生化手段从牛骨中提取了可以促进成骨的生长因子，随后分离出一种非胶原性的骨蛋白——骨形态发生蛋白（BMP），成为骨科领域划时代的重大进步[17]，也奠定了骨科从简单的机械力学治疗向生物综合治疗的转变。Wozney 等[18]在1988年确定BMP-2是具有很强成骨活性的生长因子，为BMP 家族中单独诱导异位成骨能力最强者。BMP-2诱导成骨的方式主要是软骨内成骨，由间充质细胞先分化为软骨组织，在由软骨组织钙化成骨；也可膜内成骨，由间充质细胞直接形成新生骨[19]。其生物学特性主要是刺激未分化的间充质细胞粘附、增殖和定向分化，从而诱导新骨的形成[20-21]。

BMP-2蛋白质多采用基因工程制作，其工艺复杂、成本高、价格昂贵，很难大规模生产。本课题组根据BMP-2受体II 结合域的核心区域设计出仅含24个氨基酸的多肽，其生产简单，空间结构呈线状，活性位点能充分显露，成骨作用单一，克服了BMP-2其他功能域所带来的不必要的生物学效应。先前的实验也证明P24多肽对间充质细胞具有定向骨诱导作用和异位成骨作用[22-23]。目前，研发具有骨诱导活性的小分子多肽已成为骨组织工程的研究热点。Lee J-Y[24]等用促成骨活性区域 （Osteopromotive domain，OPD）的“DWIVA”序列，制成具有两亲性的多肽化合物（OPDA）。其纳米凝胶在10天左右能显著促进人骨髓基质细胞的增殖和成骨分化，ALP表达量也显著提高。Lin X [25]等设计一个86-100氨基酸残基为核心的多肽，即B2A2。其不具有独立的成骨或骨诱导活性，但是能有效地协同BMP-2进行骨诱导作用，在协同性能的离体实验中，仅需要ng 级的BMP-2就能体现活性，BMP-2的使用量减少1/40-1/4。本课题组的P24多肽来源于BMP-2的“指端表位”，同时我们对该多肽进行了优化设计，在多肽的两端加上磷酸化的丝氨酸以及天冬氨酸，从而使多肽与材料结合后在局部形成磷酸基、羧基等阴离子活性基团，从而促进钙磷离子的沉积起到调控机体内生物自组装矿化的作用，促进骨的再生。

根据仿生原理，本课题组与清华大学材料系合作制备了纳米骨基质材料—纳米晶磷酸钙/I型胶原，其结构在纳米尺度上为磷酸钙晶体，在微米和毫米上疏水多孔结构，材料的孔隙率约为80%，空隙大小主要分布在 100～400微米，这些相互连通的孔洞有利于血管营养的运输、细胞的迁移和成骨破骨

等生理活动的进行。I 型胶原不仅可为成骨细胞提供支架作用，还可以促进矿物质沉积；同时具有低抗原性、生物可降解性和生物可吸收性。这种成分和结构具备了良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性。为了进一步改善其骨诱导活性，本实验将纳米晶磷酸钙/I型胶原负载具有良好骨诱导活性的BMP-2活性肽。

本实验采用大鼠颅骨缺损模型作为评价材料促进骨再生能力强弱的动物模型。大鼠颅骨缺损模型不仅简易、经济、对比性强，而且在不植入材料时不能自我完全修复[26-28]。临界大小骨缺损（critical size defect）是指在动物的生命期内不能自发愈合的最小的骨缺损，在生理条件下能愈合但在病理条件下不能愈合的骨缺损不包括在内 [29]。也就是健康动物在其生命期内不能靠自身修复10%的骨缺损，如果一年内未达到这个目标，便可认为此模型符合临界大小骨缺损的标准

[30-31]。一般认为大鼠颅骨缺损直径8mm 或5mm 都可以称为临界大小骨缺损，本实验采用直径5mm 的缺损不需要跨越大鼠颅骨矢状缝，避免了损伤矢状窦静脉，提高了手术成功率也避免了出血干扰实验结果[32]。根据前期实验已确定的BMP-2活性多肽诱导异位成骨的最佳剂量，并结合本实验的动物模型，我们采用每个材料复合5mg 活性多肽，以提高成骨的稳定性，并与3ug rhBMP-2进行成骨活性对比[33]。

为了评价P24/nHAC复合材料的促进骨修复能力，本实验将5mgP24与nHAC 复合，植入大鼠颅骨缺损，以空白空洞、单纯材料和3ug rhBMP-2做为对照，于术后6周和12周进行影像学观察、组织学观察。从影像学观察显示，在6周和12周P24的成骨能力均明显优于空白材料组和单纯空洞组，在12周P24组和rhBMP-2组基本修复缺损部位，由骨桥连接缺损。P24和rhBMP-2组不仅在缺损周边有新生骨，在材料的中心也发现大量新生骨，这也证明了材料多孔结构具有良好的空隙连接，使微血管和成骨细胞向中心迁移。组织学观察，6周时空白组材料少许降解，无明显炎症反应，P24组和rhBMP-2组可见少量新生骨组织和代谢旺盛的成骨细胞。12周时空白组缺损区有大量纤维结缔组织，有少量新生骨在材料周边发现，P24组和rhBMP-2组材料基本降解，有骨重建过程，但A 组成骨量少于B 组。12周的P24组和rhBMP-2组成骨量和材料降解度明显优于6周时，也证明了本材料对P24和rhBMP-2起到了很好的缓释作用同时募集并诱导骨

髓基质干细胞分化为破骨细胞而加速材料的降解。Minori[35]等在LA-DX-PEG/β-TCP 复合BMP-2诱导异位成骨的实验中也观察到了这个现象，这种被加速的材料降解有利于新骨的长入和重塑，因而有利于骨缺损的修复[33]。

综上所述，本研究制备的BMP-2活性肽/纳米晶胶原基复合材料在一定程度上达到了对天然骨的结构仿生及功能仿生，具有良好的骨诱导活性。在本次实验中5mgP24多肽组的成骨活性不管在影像学还是组织上均相当于3ug 的rhBMP-2组，其成骨的稳定性也得到证实。多肽剂量虽然为mg 级，但其价格低廉、良好的安全性能和生产的简易使其仍具有良好辽阔的市场应用前景。在下一步的实验中，我们还将对多肽进一步改造，使其分子量更小、生物活性和稳定性更加优良。如果BMP-2活性肽能应用于临床，不仅极大丰富了骨组织的来源给患者带来希望，也蕴含着无限的商机。

附 图

图1： 纳米晶胶原基复合多孔支架材料大体观

图2： 颅骨缺损模型与植入材料后大体观

A 组12周取材 B 组12周取材

C 组12周取材 D 组12周取材

图3： 术后12周各组标本肉眼正面观

A 组P24/nHAC复合材料6周、12周X 线观察

B 组 rhBMP-2/nHAC复合材料6周、12周X 线观察

C 组 空白nHAC 支架材料6周、12周X 线观察

D 组 单纯空洞组6周、12周X 线观察

图4： 术后6周、12周各组材料修复骨缺损X

片

A 组 P24/nHAC复合材料6周、12周三维重建

B 组 rhBMP-2/nHAC复合材料6周、12周三维重建

C 组 空白nHAC 支架材料6周、12周三维重建

D 组 单纯空洞组6周、12周三维重建

图5：术后6周、12周各组材料修复骨缺损CT 三维重建观察

19

A 组 P24/nHAC复合材料6周、12周冠状面断层扫描

B 组 rhBMP-2/nHAC复合材料6周、12周冠状面断层扫描

C 组 空白nHAC 支架材料6周、12周冠状面断层扫描

D 组 单纯空洞组6周、12周冠状面断层扫描

图6：术后6周、12周各组材料修复骨缺损冠状面断层扫描图

20

6周 12周

A 组6周材料开始降解，少量成骨细胞散在分布于材料中。12周材料大部分降解，可见成熟骨组织。

B 组6周材料降解较多，大量代谢旺盛成骨细胞分布于材料中。12周材料基本降解完全，大量分化成熟骨组织。

21

C 组6周材料部分降解，少许结缔组织长入材料，无明显炎性反应。12周仍有材料残留，纤维组织密集，少量成骨。

D 组6周宿主骨周边炎性反应，未见成骨细胞。12周宿主骨旁大量瘢痕结缔组织，无明显成骨。

图7：6周，12周各组组织学观察（HE染色，100倍光镜）。

参考文献

1. Weiland.A.J, Phillips.T.W., Randolph M. Bone grafts: a radiologic,

histologic and biomechanical model comparing autografts, allografts and free vascularized bone grafts. Plast. Reconstructr. Surg. 1984, 74:368–379.

2. DeLuca L., Raszewski R., Tresser N, et al. The fate of preserved

autogenous bone graft. Plast. Reconstructr. Surg,1997,99:1324–1328.

3. El-Ghannam A.Bone reconstruction: from bioceramics to tissue

engineering. Expert Rev Med Devices. 2005 Jan;2(1):87-101.

4. Khan Y, Yaszemski MJ, Mikos AG,et al. Tissue engineering of bone:

material and matrix considerations. J Bone Joint Surg Am. 2008 Feb;90 Suppl 1:36-42.

5.Clemens Scheufler, Walter Sebald， Martin HuÈ lsmeyer.Crystal Structure of Human Bone Morphogenetic Protein-2 at 2.7 AÊ Resolution. J. Mol. Biol, 1999;287:103-115.

6.David M,Patrical A,James M,et.al. Sequential actions of BMP receptors control neural precursor cell production and fate.Genes

Dev,2001,15:2094-2110.

7.Chun-Ya E. Han , Youping Wang, Longchuan Yu , et.al. Small molecules with potent osteogenic-inducing activity in osteoblast

cells.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters , 2009, 19 :1442–1445.

8.Milan Milovancev, Peter Muir, Paula Manley, et al. Clinical Application of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 in 4 Dogs. Journal of The American College of Veterinary Surgeons, 2007,36:132-140.

9.Seeherman H, Bouxsein M, Kim H, et al: rhBMP-2/calcium phosphate matrix accelerates osteotomy-site healing in a non-human primate model at multiple treatment times and concentrations. J Bone Joint Surg Am ,2006,88:144–160.

10.Zhao B, Katagiri T, Toyoda H, Takada T, Yanai T, Fukuda T, et al. Heparin

potentiates the in vivo ectopic bone formation induced by bone morphogenetic protein-2. J Biol Chem，2006，281(32):23246–53.

11.Kirsch T, Sebald W, Dreyer MK. Crystal structure of the BMP2-BRIA

ectodomain complex. Nat struct Biol,2000, 7(6):492-296.

12.Dionys Weber, Alexander Kotzsch, Joachim Nickel,et,al. A silent H-bond

can be mutationally activated for high-affinity interaction of BMP-2 and activin type IIB receptor. BMC Structural Biology 2007, 7:6 1472-6807-7-6

13. Bin Wu, Qixin Zheng, Xiaodong Guo, et al. Preparation of scaffold based

on mineralized recombinant human-like collagen laoding with synthetic BMP-2-derived peptide and its ectopic osteogenesis in vivo. Biomed Mater. 2008 Dec;3(4):44111.

14.Duan Z, Zheng Q, Guo X, et al. Experimental research on ectopic

osteogenesis of BMP-2-derived peptide P24 combined with PLGA copolymers. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2007 Apr;27(2):179-82.

15.Riminucci M, Bianco P. Building bone tissue: matrices and scaffolds

in physiology and biotechnology. Braz J Med Biol Res, 2003, 36(8): 1027-1036.

16.廖素三，崔福斋，张伟. 组织工程中胶原基纳米骨复合材料的研制.中国医学

科学院学报,2003,25(1):36-38

17.Urist MR. Bone formation by autoinduction. Science,1965;150:893–899.

18. Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone

formation: Molecular clones and activities. Science, 1988,242:1528–1534.

19.Tsumaki, Noriyuk6; Yoshikawa, Hideki. The role of bone morphogenetic

proteins in endochondral bone formation. Cytokine and Growth Factor Reviews, 2005, 16(3): 279-285.

20. Wozney J，Seeherman H. Protein-based tissue engineering in bone and

cartilage repair. Curr Opin Biotechnol，2004，15(5)：392-398.

21. Boden SD. The ABCs of BMPs. Orthop Nurs，2005，24(1)：49-54.

22. Kugimiya F, Kawaguchi H, Chung UI. BMP and bone formation[J] .Clin

Calcium, 2004, 14(1): 173- 179.

23.段智霞,郑启新,郭晓东,等. BMP2活性多肽/PLGA复合物植入异位成骨的实验

研究. 国际生物医学工程杂志,2007,30(3):129-132.

24.Lee J-Y, et al. Osteoblastic differentiation of human bone marrow

stromal cells in self-assembled BMP-2 receptor-binding peptide-amphiphiles.Biomaterials(2009),doi:10.1016/j.biomaterials.2009.03.018.

25.Lin X, Zamora PO, Albright S, et al. Multidomain Synthetic Peptide B2A2

Synergistically Enhances BMP-2 In Vitro. J Bone Miner Res,2005 ;204:693-703.

26.Kim CS, Kim JI, Kim J, et al. Ectopic bone formation associated with

recombinant human bone morphogenetic protein-2 using absorbable collagen sponge and beta tricalcium phosphate as carriers. Biomaterials, 2004,19:1–7.

27.Pang EK, Paik JW, Kim SK, et al. Effect of recombinant human bone

morphogenetic protein-4 dose on bone formation in rat calvarial defects. J Periodontol, 2004,75: 1364–70.

28.Han DK, Kim CS, Jung UW, Chai JK, Choi SH, Ckim CK, et al. Effect of

a Fibrin-fibronectin sealing system as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-4 on bone formation in rat calvarial defects. J Periodontol, 2005,76(12):2216–22.

29.Schmitz JP，Hollinger JO. The critical size defect as an experimental

model for craniomandibulafacial nonuions. Clin Orthop，1986，205：299-308.

30.Hollinger JO，Kleishmidt JC. The critical size defect an experimental

model to test bone repair materials. J craniofac Surg，1990，1(1)：60-68.

31.Xiao DM，Xu ZS，Lin BW，et al. Reparation of experimental models of

osseous nonunion. Chines Journall of Rehabilitation. 2005，9(30)：214-215.

32.Jones L, Thomsen JS, Mosekilde L, et al. Biomechanical evaluation of

rat skull defects, 1, 3, and 6 months after implantation with osteopromotive substances. J Craniomaxillofac Surg. 2007 Dec;35(8):350-7.

33．Bin Wu, Qixin Zheng, Xiaodong Guo, et al. Preparation of scaffold based

on mineralized recombinant human-like collagen laoding with synthetic BMP-2-derived peptide and its ectopic osteogenesis in vivo. Biomed Mater. 2008 Dec;3(4):44111. Epub 2008 Nov 25.

34. Kato M, Namikawa T, Terai H, et al. Ectopic bone formation in mice

associated with a lactic acid/dioxanone/ethylene glycol

copolymer-tricalcium phosphate composite with added recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biomaterials. 2006

Jul;27(21):3927-33.

35. Kaneko H, Arakawa T, Mano H, et al. Direct stimulation of osteoclastic

bone resorption by bone morphogenetic protein (BMP)-2 and expression of BMP receptors in mature osteoclasts. Bone 2000;27:479–86.

全文小结

实验采用自主设计的BMP-2活性肽P24与清华大学材料系研发的纳米骨

支架材料复合修复大鼠颅骨缺损，通过与已证明具有骨诱导活性的rhBMP-2、空白纳米骨支架材料和单纯空洞比较，来验证P24的成骨活性。实验证明P24组的成骨活性明显优于空白材料组和单纯空洞组，5mg多肽组成骨效果略近似于3ug rhBMP-2组。我们可以得出以下观点：

1. P24是一种具有稳定成骨活性的BMP-2多肽。

2. 纳米晶胶原基支架材料不仅是一种具有骨诱导和骨传导活性的支架材料，

而且对细胞因子具有良好的缓释效果。

3. 从成骨效果来看5mg 多肽近似于3ugrhBMP-2，成骨剂量为mg 级仍需进一

步改造提高成骨活性。

4. P24/nHAC复合材料是一种潜在的可用于临床的新型骨缺损修复材料。

综 述

骨形态发生蛋白-2成骨机制及其成骨活性多肽应用研究现状

贺永进综述 郭晓东审阅

摘要 骨形态发生蛋白-2 （Bone morphogenetic protein-2,BMP-2）是一种低分子量糖蛋白，属于TGF 超家族成员，参与骨的器官发生、骨的形成与骨修复的过程，同时对神经系统、造血系统的分化发育也有调控作用。其具有成骨活性的相关多肽具有分子量小、生物活性高、稳定性好、副作用小等优点，为骨缺损的的治疗带来深刻变革并已成为该研究领域的焦点。

关键词 骨形态发生蛋白-2；活性多肽；成骨机制。

1965年，Urist首次从牛脱钙骨中发现一种可以促进成骨的生长因子，随后分离出一种非胶原性的骨蛋白——骨形态发生蛋白（BMP），成为骨科领域划时代的重大进步，也奠定了骨科从简单的机械力学治疗向生物综合治疗的转变。研究表明，在涉及骨和软骨发生的众多生长因子中，BMP是目前发现的能够单独诱导异位成骨的唯一生长因子，是骨组织形成过程中最关键的调节因子，在所有BMP亚型中，BMP-2是研究最为广泛，同时也是公认的成骨活性最强的细胞因子[1-3]。本文就近年来对BMP-2的信号转导、成骨过程、影响因素及其具有成骨活性多肽在促进成骨分化及骨缺损修复的研究现状综述如下。

1. BMP-2的成骨机理

1.1 BMP-2的信号转导：BMP-2可以和两种丝氨酸-苏氨酸受体结合，受体分为两种类型，即BMPⅠ型和Ⅱ型受体。前者又分为BMPRⅠa、Ⅰb和ActⅠ,后者包括BMPRⅡ、ActⅡ和ActⅡb。两种受体中I 型亲和性较高，II型亲和性较低，与以上两个受体结合的BMP-2上配体区域为“腕状表位”（wrist epitope）和“指端表位”（knuckle epitope）。受配体复合体晶体结构表明：Ⅰ型受体主要和腕状表位结合，Ⅱ型受体主要和指状表位结合。每个BMP-2单体与两个受体形成三聚体结构，整个BMP-2分子则与一共4个受体形成六聚体结构[4]。在激活信号转导途径之前，由于BMP-2 分子与细胞表面接触，引起细胞表面受体集聚。而后，BMP-2分子与BMPRⅡ结合，后者使BMPRⅠ受体磷酸化，激活细胞内的ERK-MAPK 级联信号通路。继而三者形成寡聚体，活化的BMPRⅠ型受体磷酸化Smad1, Smad5

and Smad8，然后与Smad4一起装配形成杂聚肽复合体，转运至细胞核调控靶基因的转录过程，并引发一系列生物学效应[5]。但Smad6与BMPRIB 结合后可以不被磷酸化，选择性抑制BMP-2受体信号传递，Smad7通过竞争结合Smad4而抑制BMP-2的信号转导。

1.2 BMP-2的诱导成骨过程：BMP-2诱导成骨的方式主要是软骨内化骨，即结缔组织内的间充质细胞先分化为软骨组织，继而在软骨组织的基础上进行钙化成骨；也可以膜内成骨，即新生骨组织在结缔组织膜中由间充质细胞直接形成[6] 。目前认为BMP-2诱导成骨作用大致可分为4个时期：趋化期、分化期、骨质形成期和重塑期，即间充质细胞发生生物性的聚集、粘附，再分化为软骨和骨，最后形成骨髓。在损伤后的骨修复与骨重塑过程中，首先由于炎症反应和局部含氧量降低导致大量细胞因子和生长因子在损伤部位释放，继而间充质细胞、成纤维细胞发生聚集，在局部BMP-2的作用下分化为骨原细胞，随后细胞外基质部分出现钙化，伴随着血管的增生有编织骨形成，最后形成板层骨和骨髓。

1.3 BMP-2成骨作用的影响因素：大量研究证明，通过协同作用BMP-2的活性受到全身性或局部的激素和生长因子的影响，如肾上腺皮质激素、碱性成纤维细胞因子（bFGF）、前列腺素、维生素D及雌二醇等。实验表明，低剂量的bFGF可与BMP-2产生正协同作用，提高小鼠骨髓基质干细胞定向成骨分化的能力，当其剂量达到一定浓度时反而抑制BMP-2的活性，将二者同时使用能促进成纤维细胞成骨表型表达并促进细胞增殖[7]。在含有5mmol/Lβ-甘油磷酸，100nmol/L地塞米松，50μmol/L抗坏血酸二磷酸的成骨培养基中，rhBMP-2对早期人骨髓基质干细胞的成骨分化能力也大大加强[8]。在诱导鼠MC3T3细胞成骨分化的实验中，rhBMP-2联合β-雌二醇组细胞ALP含量明显高于单纯rhBMP-2。维生素D也可增强rhBMP-2诱导大鼠肌袋异位成骨的能力。这些研究表明： BMP-2能与一些生长因子或激素产生协同作用增加其成骨诱导的效果，而成骨诱导的抑制作用也可能是由于动物或病人自身局部或全身性的激素和生长因子所造成的

成骨能力必须要考虑到全身的综合因素。

2. 具有成骨活性的BMP-2多肽应用现状

2.1 由于BMP-2具有多重生物学效应，除诱导成骨外，在胚胎发育、器官发生、细胞增殖分化及凋亡中也有重要作用，如果超生理剂量使用可能对其它器官和组 [9]。因此要加强BMP-2的定向

织产生不必要的副作用；同时，其生产及纯化工艺复杂、成本高、半衰期短、需反复或大剂量给药，故价格非常昂贵，亦存在基因工程产品潜在的安全性问题[10]。 对应BMP-2成骨活性区段的相关小分子多肽可简便、快速地用多肽合成仪大规模合成，能够有效克服用基因工程技术制备大分子蛋白质时工艺复杂、成本高、价格昂贵的缺点，而且活性多肽可发挥与其蛋白质类似的作用，同时短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面相应的受体结合，达到较好的生物活性。

2.2 日本Saito A 团队在先前的研究中，将对应BMP-2单体68-87位氨基酸合成的10肽结合在藻酸盐水凝胶上进行大鼠的异位成骨研究，发现等剂量药物其效果不如BMP-2，但是明显优于对照组[11]。随后，通过在BMP-2单体上进行肽段的剪切，获得最具有成骨活性的73-92位多肽，并能特异结合BMP-2晶体结构的“指状表位”区，通过与藻酸盐水凝胶结合并植入大鼠腓肠肌，有明显的异位成骨作用，并且优于68-87位多肽[12]。由于BMP-2作为药物使用存在短时间大量释放的“暴释”现象，通过对多肽-水凝胶材料进行观察，发现7周以上仍有成骨活性，而BMP-2-水凝胶材料在5周之后就已经失效[13]。进一步的研究发现，在缺少干细胞的环境中，多肽难以表达成骨的效果，需加入干细胞如骨髓干细胞才能保持药物的效果。在后续的实验中，73-92位的多肽进行了改进和修饰（cys78、cys79、met89被换成了ser、ser、thr）, 与α-三磷酸钙盐支架结合，以5mg 的剂量对20mm 的兔子长骨骨质缺损进行修复，在12周已完全修复缺损，并证明多肽能有利于材料的降解，同时促进骨的再生[14]。

2.3 韩国Lee JY团队在早期的研究中，取得具有受体结合能力的BMP-2肽段，并将它覆盖在钛表面，以增强成骨细胞类似细胞MC3T3-E1细胞在材料表面的吸附、生长，并在离体实验中有较好的ALP表达量[15]。随后为增强骨质再生能力，从BMP-2上截取能与BMPRⅠ、BMPRⅡ共同结合的含有15个氨基酸残基多肽，其中含有“DWIVA”核心序列，命名为P1。为增强肽段在材料表面的结合能力，该团队在P1多肽的N端加上7个Glu，命名为P2。经实验证明，P1与P2在成骨活性上没有统计学差异，仅在与材料结合能力上有差异,且此15肽参与的信号途径与BMP-2一致

[16]。在骨质缺损修复方面，上述材料用于兔子颅骨直径10mm的缺损修复，在4周时有明显的骨质生长[17]。在最近的报道中[18]，用促成骨活性区域

（Osteopromotive domain，OPD）的“DWIVA”序列，制成具有两亲性的多肽化

合物（OPDA）。其纳米凝胶在10天左右能显著促进人骨髓基质细胞的增殖和成骨分化，ALP表达量也显著提高。

2.4 美国Lin X 等在回顾研究日本团队研究的同时，设计一个86-100氨基酸残基为核心的多肽，即B2A2。其不具有独立的成骨或骨诱导活性，但是能有效地协同BMP-2进行骨诱导作用，在协同性能的离体实验中，仅需要ng 级的BMP-2就能体现活性，BMP-2的使用量减少1/40-1/4。这可能与其具有信号转导途径激活前促进细胞表面受体集聚的能力有关[19-20]。

2.5 中国郭晓东团队组根据BMP-2受体II 结合域的核心功能片段设计出仅含有24个氨基酸活性多肽，以"指状表位"的第73-92肽段为基础，于活性多肽两端的序列中加入磷酸化的丝氨酸和天冬氨酸，这些氨基酸能在复合材料表面形成磷酸基、羧基等阴离子活性基团，从而促进钙磷离子的沉积、晶体的成核生长和自组装矿化，起到调控机体内生物自组装矿化的作用，促进了其成骨的效能。通过复合PLGA 材料P24活性肽于6周成功诱导大鼠股四头肌异位成骨[21]。后续实验采用3mgP24活性肽与nHAC/PLGA复合移植，12周观察成功修复大鼠颅骨5mm 极限缺损[22]。将其与I 型胶原煅烧骨复合于12周完全修复兔桡骨的20mm 极限缺损

[23]。

3.结束语

随着BMP-2空间结构和信号转导机制的深入研究，为设计其成骨活性小分子多肽提供了依据和借鉴，也为设计研发高效、稳定、安全、经济的BMP2小分子活性肽药物奠定了基础。生物材料技术的发展、临床对骨需求的急剧增加，为人工骨应用于临床带来了希望。这种小分子药物具有着重大的科学意义、广阔的临床应用前景和很强的市场竞争力。

参 考 文 献

1.Urist MR. Bone formation by autoinduction. Science,1965;150:893–899.

2.Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ,Kriz RW, Hewick

RM, Wang EA. Novel regulators of boneformation: molecular clones and activities. Science,1988;242:1528–1534.

3.Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, Hewick RM, Rosen V,Wang EA, Wozney JM. Identification of transforming growthfactor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone. Proc Natl Acad Sci U S A ,1990;87:9843–9847.

4.Clemens Scheufler, Walter Sebald， Martin HuÈ lsmeyer.Crystal Structure of Human Bone Morphogenetic Protein-2 at 2.7 AÊ Resolution. J. Mol. Biol, 1999;287:103-115.

5.David M,Patrical A,James M,et.al. Sequential actions of BMP receptors control neural precursor cell production and fate.Genes

Dev,2001,15:2094-2110.

6.孟国林，胡蕴玉.联合使用骨形态发生蛋白和碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞成骨型的影响.中国临床康复，2002，6（4）：498-499.

7. Tsumaki, Noriyuki; Yoshikawa, Hideki. The role of bone morphogenetic

proteins in endochondral bone formation. Cytokine and Growth Factor Reviews, 2005, 16(3): 279-285.

8.In Sook Kim,Yoon Mi Song,Tae Hyung Cho,et.al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Develop. Growth Differ, 2008;50:553–564.

9.陈凌，高建明，张彦定.骨形态发生蛋白成骨机理及应用现状.福建医药杂志，2004，26（1）：119-121.

10. Reddi AH. Role of morphogenetic proteins in skeletal tissue

engineering and regeneration. Nat Biotech ,1998;16:247–252.

11.Suzuki Y, Tanihara M, Suzuki K, Saitou A, Nishimura Y.Alginate hydrogel

linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res, 2000;50:405-409.

12.Saito A, Suzuki Y, Ogata S, et.al. Activationof osteo-progenitor cells

by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogenetic protein-2 knuckle epitope. Biochim Biophys Acta ,2003;1651:60–67.

13.Saito A, Suzuki Y, Ogata S, Ohtsuki C, Tanihara M. Prolonged ectopic

calcification induced by BMP-2-derived synthetic peptide.

J Biomed Mater Res ,2004; 70A:115–121.

14.Saito A, Suzuki Y, Ogata S, Ohtsuki C, Tanihara M. Repair of 20-mm long

rabbit radial bone defects using BMP-derived peptide combined with an α-tricalcium phosphate scaffold. J Biomed Mater Res A,2006;

77:700-706.

15.Seol YJ, Park YJ, Lee SC, Kim KH, et.al. Enhanced osteogenic promotion

around dental implants with synthetic binding motif mimicking bone morphogenetic protein (BMP)-2.J Biomed Mater Res A,2006;77:599-607.

16.Lee JY,Cho JE, Park JB, Park JH, Lee SC,et.al. Synthetic peptide-coated

bone mineralfor enhanced osteoblastic activation in vitro and in vivo. J Biomed Mater Res A,2008;87:688-97.

17.Park JB,Lee JY,Park HN,Seol YJ, et.al.Osteopromotion with synthetic

oligopeptide-coated bovine bone mineral in

vivo.JPeriodontol,2007;781:157-63.

18.Lee J-Y, et al. Osteoblastic differentiation of human bone marrow

stromal cells in self-assembled BMP-2 receptor-binding peptide-amphiphiles.Biomaterials(2009),doi:10.1016/j.biomaterials.2009.03.018.

19. Lin X, Zamora PO, Albright S, et al. Multidomain Synthetic Peptide

B2A2 Synergistically Enhances BMP-2 In Vitro. J Bone Miner Res,2005 ;204:693-703.

20. Lin X, Elliot JJ, Carnes DL,et al.Augmentation of Osseous Phenotypes

In Vivo with a Synthetic Peptide .J Orthop Res,2007;254:531-9.

21.段智霞,郑启新,郭晓东,等. BMP2活性多肽/PLGA复合物植入异位成骨的实验

研究. 国际生物医学工程杂志,2007,30(3):129-132.

22.吴斌,郑启新,郭晓东等.BMP-2活性多肽/重组胶原矿化骨复合材料修复大鼠

颅骨缺损的实验研究.中华创伤杂志，2008，24（12），1010-1012.

23.李景峰，郑启新，郭晓东等.骨形成蛋白2活性多肽／I型胶原复合煅烧骨修

复兔桡骨缺损.中华实验外科杂志，2009，Jun,26:56-58.

附录

硕士期间参与课题及发表文章情况

“十一五”国家高技术研究发展计划（863）干细胞与组织工程重大项目； 国家自然科学基金资助项目（30973027）；

教育部“新世纪优秀人才支持计划”资助项目（NCET-05-0647）.

骨形态发生蛋白-2对人脐带间充质干细胞增殖和分化的影响.中华实验外科杂志,2010,27(11):1602-1605.

骨形态发生蛋白2联合氯化锶对人脐带间充质干细胞增殖和成骨分化的影响.中华实验外科杂志,2011,28(2):288-291.

B MP-2活性肽/纳米晶胶原基骨修复材料复合移植修复大鼠颅骨缺损的实验研 究(已完成)

致 谢

“问渠那得清如许，为有源头活水来”。恩师郭晓东教授的严谨治学和一丝不苟的科研态度，正是我们课题组不断取得重大突破的源头活水。衷心的感谢我的导师郭晓东三年来在学习、工作和生活中对我的悉心指导和培养，在我每一点一滴的成长中都凝聚着导师的心血和关爱。郭教授高尚的人格魅力、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风，将使我受益终生，并时刻激励着我在今后的学习工作中不断进取，努力拼搏。

感谢骨科杨述华教授、杜靖远教授、郑启新教授、邵增务教授、王洪副教授、刘国辉副教授、刘勇副教授、肖宝钧副教授、叶哲伟副教授、杨操副教授、段德宇副教授、吴宏斌副教授、李进副教授、刘建湘副教授、熊晓芊博士、郑东博士、张宇坤博士、吴斌博士、汪岚老师以及全科医护人员在临床、科研等方面给予的帮助和培养。

衷心感谢杨大志博士、李景峰博士、滕宇博士、柴斌博士、兰生辉博士、王玉龙硕士、姬彦辉硕士、孙川硕士等同窗好友在学习生活上的关怀和帮助。祝你们今后家庭美满、工作顺心、生活幸福。十分怀念和你们在一起的美好三年。

感谢清华大学材料系的王明波博士在实验中为我提供诸多帮助。感谢清华大学材料学系崔福斋教授和冯庆林教授对本课题组长期以来的指导和帮助。

最后我要感谢我的父母、爱人和女儿对我默默的支持、鼓励和理解。三年来聚少离多，今后我一定要做一名孝顺的儿子、称职的丈夫和合格的父亲。

谨以此文献给所有关心、支持和爱护过我的人们，愿你们一生幸福、平安！