文昌鱼石蜡连续切片的制作和苏木精_伊红染色

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解剖学研究年第卷第期·技术方法·

文昌鱼石蜡连续切片的制作和苏木精－伊红染色

雷佳瑶，

徐

晔，

顾怀宇

广东

广州510080）

方法

利用LeicaEG1150分体

（中山大学中山医学院人体解剖学教研室，

【摘要】

目的

介绍文昌鱼石蜡连续切片的制作和苏木精－伊红（HE）染色的方法。

式石蜡包埋机；LeicaVT1000S手动轮转切片机；LeicaHI1210摊片机；LeicaHI1220烘片机制作文昌鱼石蜡连续切片并进行HE染色。依据对脱水和透明过程中文昌鱼外观的变化以及镜下切片结果的反复比较，总结出各个步骤的时间参数。结果

利用上述方法获得清晰的文昌鱼石蜡连续HE染色切片，我们选择了头部、胸部、腹部、尾部四个有代表性的文昌鱼

本文成功建立文昌鱼石蜡连续切片的制作和

断面，在片中可以清楚地分辨脊索、神经管、鳃、卵巢、肌节、肠等结构。结论

HE染色方法，并为研究脊椎动物的起源提供基础资料。

【关键词】

文昌鱼；

石蜡切片；

苏木精－伊红染色

Serialparaffinsectionandhematoxylin-eosinstainingoftheAmphioxus

【Abstract】

LEIJia-yao，XUYe，GUHuai-yu．Departmentof

Anatomy，ZhongshanSchoolofMedicine，SunYat-senUniversity，Guangzhou，510080，China

Objective

Tointroduceamethodforserialparaffinsectionandhematoxylin-eosinstainingoftheAmphioxus

Methods

LeicaEG1150ModularTissueEmbeddingCenter（consistingoftheLeicaEG1150CColdPlateandtheLeica

EG1150HHeatedParaffinDispensingModule），LeicaVT1000SVibratingBladeMicrotome，LeicaHI1210-Waterbath，LeicaHI1220-FlatteningTablewereutilizedtoproducetheserialparaffinsectionsaswellasobtaininghematoxylin-eosinstainingoftheAmphioxus．BycomparingtheappearancechangesandmicroscopicimagesoftheAmphioxusrepetitivelystepbystep，wefoundouttheappropriatetimecourseofeveryprocedure．Resultsneuraltube，

pharyngealgill，

ovary，

myomere，

Weattainedclearhematoxylin-eosinstainedparaffinsectionsinthat

Conclusion

We

way．Thesectionsofhead，thorax，abdomenandtailwereselectedasthefourrepresentatives，thestructuresofnotochord，

intestineoftheAmphioxuswereclearlydistinguished．

establishedasuccessfulmethodforserialparaffinsectionandhematoxylin-eosinstainingofAmphioxus，andprovidedanewwayforthefurtherresearchinoriginofvertebrates．

【Keywords】

Amphioxus；Serialparaffinsection；Hematoxylin-eosinstaining

文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的无脊椎动物，长期以来一直作为研究动物进化和胚胎发育的典型材料［1－2］。目前，文昌鱼已经被广泛用于不同物种之间的比较基因组学研究、免疫学研究等。近50年来，我国在文昌鱼生物学研究方面取得很大进展［2－3］。从形态学上说，文昌鱼没有骨质骨骼，脊索作为它的全身支柱，并由许多柱状细胞所在组成的具有韧性的膜状结构所紧密包围，内部脏器容易在组织处理过程中破碎，因此一直未能提出有效的方法供形态学研究。本文旨在提供文昌鱼石蜡切片制作和HE染色的方法，为继续开展文昌鱼研究提供参考。

通信作者：顾怀宇，E-mail：gu＿huaiyu＠yahoo．com

1

1．1

材料与方法

成年斑马鱼石蜡连续切片的制作实验动物主要试剂主要设备

原产大连文昌鱼

无水乙醇；二甲苯；4％多聚甲

1．1．11．1．21．1．3

醛；伊红和苏木素染料；石蜡。

LeicaEG1150分体式石蜡包埋

机；LeicaVT1000S手动轮转切片机；LeicaHI1210摊片机；LeicaHI1220烘片机。

1．1．4制作方法将文昌鱼禁食12h后洗净，完

整平展浸泡于4％的多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱固定8h。

按下列条件进行脱水、透明、浸蜡：①乙醇脱水：30％乙醇30℃，1h→50％乙醇30℃，1h→75％乙醇30℃，1h→95％乙醇30℃，1h→100％乙醇

解剖学研究年第卷第期

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30℃，1h（Ⅰ）→100％乙醇30℃，30min（Ⅱ）→100％乙醇30℃，30min（Ⅲ）②二甲苯透明：二甲

苯（Ⅰ）30℃，30min→二甲苯（Ⅱ）30℃，15min→二甲苯（Ⅲ）30℃，15min③浸蜡：石蜡（Ⅰ）45℃，

min→二甲苯（Ⅰ）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中

性树脂封固。

2结果

30min→石蜡（Ⅱ）45℃，30min→石蜡（Ⅲ）45℃，30min。随后用LeicaEG1150分体式石蜡包埋机

进行常规包埋，LeicaVT1000S手动轮转切片机切片，厚度为5μm。

通过探索，我们染出了清晰的文昌鱼HE连续切片（厚度为5μm）。实验的成年文昌鱼体长约3cm，以头部为起始，我们从每1mm身长的切片中挑选1张图像清晰并且有代表性的片，总共获得约30张清晰的文昌鱼HE染色切片。我们挑取头部、胸部、腹部、尾部共4张包含文昌鱼典型结构的断面展示文昌鱼的主要器官和组织。

图1所示为头部切面，其中可以清楚地分辨脊索、神经管、鳃、咽腔等结构；

图2所示为胸部切面，其中可以清楚地分辨胸部主要脏器鳃以及卵巢；

图3所示为腹部切面，其中可以清楚地分辨腹部主要器官卵巢和消化道（肠）；

图4所示为尾部切面，可见有消化道末端以及丰富的肌肉组织。

1．2文昌鱼连续石蜡组织切片的HE染色及制

作步骤

HE染色及切片制作需要经过脱蜡、水化、HE

染色、脱水、透明：①切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇水洗：二甲苯（Ⅰ）5min→二甲苯（Ⅱ）5

min→100％乙醇1min→95％的乙醇1min→80％

乙醇1min→70％乙醇1min→蒸馏水洗1min。②苏木素染色7min，自来水冲洗。③0．5％～1％盐酸乙醇分化30s。④流动自来水冲洗30s。⑤置伊红液1min。⑥常规脱水，透明，封片：90％乙醇（Ⅰ）

1min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（Ⅰ）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（Ⅲ）1

1．脊索；2．咽；3．鳃板；4．神经管；5．眼点；6．肌节；7．肠；8．软骨；9．卵巢；10．卵

图1HE染色，×4，示头部切面图2HE染色，×4，示胸部切面图3HE染色，×4，示腹部切面图4HE染色，×

4，示尾部切面

3

3．1

讨论

腹部集合了肝、卵巢、消化道等，所以在切片时要特别保护这些极易碎裂的重要组织和器官，结构的完整性是制得高质量切片的前提。在脱水、透明、浸蜡的过程中，更要综合考虑胸腹内主要脏器，不断地调整各个步骤的时间，以保证石蜡切片的质量。最终，我们摸索出了一套可以对文昌鱼进行连续切片的处理方法。

另外，在裱片时，为了保持切片之间的连续性，我们在已包埋的蜡块右上角作一个三角形切

文昌鱼石蜡切片的制作体会

制作高质量的文昌鱼HE连续切片，石蜡切片

的制作起着关键的作用。在进行整条鱼的连续石蜡切片之前，我们先利用4％的多聚甲醛对文昌鱼进行8h固定并保存于4℃冰箱，固定过程中应该保证鱼体是平展的，尽量避免弯曲，提高切片的质量。

文昌鱼个体小，内部的脏器较小、较集中，胸

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解剖学研究年第卷第期口以作标记，以保证表片的方向保持一致［4］。裂及背神经索等脊索动物所具有的特征结构。本文提供文昌鱼石蜡切片及HE染色方法为研究脊椎动物的起源提供基础资料．

参

1．

3．2文昌鱼连续切片HE染色的操作体会染色过程中所用试剂的质量也对染色的结果

有着决定性的作用。因此在染色之前，要对染液苏木素和伊红进行过滤处理，将沉淀物和杂质除去，特别需要强调的是要将苏木素的结晶去除，否则将影响切片的质量，并且每次使用的试剂都应尽可能新鲜，以使组织脱水和透明彻底，保证镜下的视野清晰、切片的结构清楚。其中需要着重指出的是伊红后80％、90％的酒精必须是新鲜配制，否则将影响切片的清晰度

［4］

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经过各个步骤的严格操作，我们最终顺利制得厚度为5μm的连续切片，并且镜下图像清晰。

3．3文昌鱼HE染色切片制作的意义

文昌鱼一直被认为是无脊椎动物进化到脊椎

73－75．

（收稿日期：2010-03-26）

动物的过渡动物，它的幼体及成体均包含脊索、鳃

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

（上接第376页）

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