外切_葡聚糖酶

网络出版时间：2014-01-15 15:23

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外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

孔芹，方浩，夏黎明

（浙江大学 生物质化工教育部重点实验室，化学工程与生物工程学系,浙江，杭州 310027）

摘要：外切-β-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一，提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。本文分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法，对已有的基因重组转化子进行筛选试验，获得了6个优良转化子，其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验，获得了外切-β-葡倍；分析结果表明：重组转化子的纤维素酶体系中内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大，但由于外切-β-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高，纤维素酶的总活力（滤纸酶活力FPA）也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验，当酶用量为20 FPIU·g-1底物，水解48 h，重组转化子ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%关键词：重组里氏木霉；外切-β-葡聚糖酶；转化子筛选；玉米秸秆；酶水解

中图分类号： TQ920 文献标志码：0438-1157（2013）00-0000-00

聚糖酶（C1）高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h，其C1酶活力可达18.24 U·mL-1 ，是出发菌株的2.16

310027, Zhejiang, China)

Abstract:screen Trichodermareesei1T. reesei ZU-101 whose C1 activity was18.24 U·mL-1exo-ββ-glucanase and cellobiase activities varied T. reesei ZU-101’s cellulase in the FPIU·g-1 substrate and 48 h, respectively. The results of the present work have promising application prospects in the bioconversion and utilization of renewable cellulosic materials.

Key words: recombinant Trichoderma reesei; exo-β-glucanases; screening of transformants; corn stover;

enzymatic hydrolysis

引  言

纤维素是一种由D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键结合而成的葡聚糖大分子链，作为植物细胞壁的重Corresponding author:Prof.XIA L iming, [email protected]

Foundation item: Supported by the Program for Zhejiang Leading Team of S&T Innovation (2011R50002)

2013-00-00收到初稿，2013-00-00收到修改稿。 联系人：夏黎明。第一作者：孔芹（1988—），女，硕士研究生。

基金项目：浙江省重点科技创新团队计划资助（2011R50002）。

Received date:2013-00-00.

要成分，是世界上最丰富、最廉价且未得到充分利用的可再生性资源。纤维素生物质如农林业废弃物和部分城市工业废物经酶解糖化生产乙醇等生物能和其他生物基制产品，对于解决粮食短缺、能源危机和环境污染等问题意义重大

[1-3]

里氏木霉（Trichoderma reesei）重组转化子，由本实验室采用基因工程技术构建而成

[12]

，经过潮

霉素平板筛选后，于4 ℃冰箱中保存。 1.2 培养基

1）微晶纤维素（MCC）琼脂筛选培养基：磷酸二氢钾2.0 g；硫酸铵1.4 g；硫酸镁0.3 g；氯化钙 0.3 g；硫酸亚铁5.0 mg；硫酸锰1.6 mg；氯化锌1.7 mg；氯化钴2.0 mg；15 g；微晶纤维素20 g；水1000 mL；pH 4.820.1 g；硝酸钠2.5 g；0.1 g；硫；滤纸（0.5x3 cm）；

3）：葡萄糖1.0；玉米浆粉0.9；0.1；氯化钙0.05；磷酸二氢钾1.00.1。

%）：乳糖1.8；微晶纤维素2.0；玉米浆粉1.2；硫酸铵0.5；硫酸镁0.1；氯化钙0.05；磷酸二氢钾0.6；微量元素0.1；麸皮0.2；吐温80 0.02；碳酸钙0.18。 1.3 筛选方法

1.3.1 微晶纤维素（MCC）琼脂平板法 所有转化子五个或六个为一组，用切割器在转化子菌落边缘切取直径为3 mm的菌块，每个转化子取3块，分别转移到MCC筛选平板上，30 ℃恒温培养，定时观察记录每个菌落的生长直径，并计算每个转化子菌落生长直径的平均值dm。

1.3.2 滤纸崩解法 用接种针将初筛转化子转移到50 mL（250 mL三角瓶）种子培养基中，于31 ℃、200 r·min-1下，培养48 h制成液体菌种。按10%的

。纤维素资源的生

物炼制需经过三个基本步骤：粉碎、预处理、酶水解

[4, 5]

,提高纤维素酶对纤维素原料的水解效率是降

[6]

低成本提高经济效益的关键技术之一。纤维素酶是多组分的复合酶，包含三类主要成分：内切-β-葡聚糖酶（亦称CMC酶）、外切-β-葡聚糖酶（亦称C1酶、纤维二糖水解酶）、β-葡萄糖苷酶（亦称纤维二糖酶、CB）。纤维素酶在将纤维素水解成用才能完成牛仔服等棉织品的水洗整理，以内切-为主

[9、10]

[8]

[7]

要高活力的内切-β还需要高活力的外切-β得重要进展

[11、12]

作，并对优良重组转化子的产酶性能以及重组纤维素酶的水解性能进行研究，旨在获得高活力外切-β-葡聚糖酶以及高协同降解性能的纤维素酶生产菌株，对可再生纤维素资源的生物转化与利用具有重要的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

接种量将种子液加到20 mL（50 mL三角瓶）滤纸液体培养基中，30 ℃、170 r·min-1摇床培养。每个转化子做3个重复平行样，定时观察记录液体培养基中滤纸的崩解情况。 1.4 摇瓶产酶试验

将筛选到的转化子菌株接种到50 mL（250 mL三角瓶）种子培养基中，于31 ℃、200 r·min-1下培养48 h。然后按10%的接种量将种子液加到50 mL（250 mL三角瓶）发酵培养基中,30 ℃、200 r·min-1下进行产酶实验。定时取样，离心取上清液检测纤维素酶活力。

1.5 纤维素酶活力的测定

1.5.1 外切-β-葡聚糖酶（C1酶）活力测定 试管中，加入0.02 g微晶纤维素底物、1.0 mL酸缓冲溶液（0.05 M、pH 4.8）和释的酶液，50 ℃水浴中反应法

[13]

1.5.4 纤维二糖酶(CB酶)活力测定 10 mL试管中，加入1.0 mL纤维二糖溶液（0.5%、pH 4.8）、0.05 mL适当稀释的纤维素酶液，再加入0.95mL柠 檬酸缓冲液（0.05 M、pH 4.8），50 ℃水浴中反应15 min，反应结束后葡萄糖氧化酶法测定生成的葡萄糖。每分钟生成2.0 µmol葡萄糖的酶量定义为一个单位，以IU·mL-1表示。 1.6 氢氧化钠溶液预处理

[15]

后的玉

采用里氏木霉重组转化子或出发菌株生产的纤维素酶（FPA），再添加适量的纤维二糖酶和木聚糖酶（由本实验室自制）构成复合水解酶，1:5:15。在pH 4.8、50 ℃、-1条件下，酶解48 h。

酶水解得率=（还原糖×100×0.9）/(纤维素和半纤维素质量总和)

[16]

底物产生1.0 mg位，用U·mL-11.5.2用化学协会（IUPACDNS法

[13]

[14]

。

2 结果与讨论

2.1 微晶纤维素琼脂平板筛选

微晶纤维素是筛选平板中唯一的碳源，转化子对其利用率越高、dm越大，通常认为外切-β-葡聚糖酶活力也越高。

其中dp为出发菌株菌落直径，若定义Rd=dm/dp，

则Rd取决于菌体对底物MCC的利用率。微晶纤维素琼脂平板培养72 h的观察结果发现，同组实验组中：Rd＞1.37时，转化子菌落直径远大于dp；1.21＜Rd＜1.37时，转化子菌落直径明显大于dp；Rd＜1.21时，转化子与出发菌株直径差别不大。从200，

测还原糖。成1.0 µmol葡萄糖的酶量定义为一个FPA国际单位，以IU·mL-1表示。

1.5.3 内切-β-葡聚糖酶（CMC酶）活力测定 10 mL试管中，加入1.0 mL柠檬酸缓冲溶液（0.05 M、pH 4.8）配制的1%羧甲基纤维素钠，加入适当稀释的纤维素酶液，50 ℃水浴中反应30 min，DNS法

[13]

测上清液中的还原糖。每小时由底物产生1.0 mg还 原糖所需的酶量为一个活力单位，以U·mL-1表示。

个转化子中，选取每组中dm最大的转化子，即外切酶活力最大的转化子，筛选获得了10个优良里氏木

霉转化子（表1）

表1 微晶纤维素琼脂平板培养筛选结果 Tab.1 Screening results of MCC-agar plate culture

No. dp/mm

45 18

55 23

74 24

75 24

76 24

88 19

95 18

98 18

101 20

105 20

dm/mm 24

31 30 30 34 27 33 24 33 30

Rd 1.33 1.35 1.25 1.25 1.42 1.42 1.83 1.33 1.65 1.5

2.2 滤纸崩解筛选

酶活力、滤纸酶活力都明显要比出发菌株的高，其中转化子101、88、105、98的外切-β-葡聚糖酶活力彼此间差别不大，但转化子101的滤纸酶活力最活力为18.24 U·mL-1，高，其外切-β-葡聚糖酶（C1）是出发菌株的2.16倍，C1酶与FPA比值是出发菌株1.62倍。这主要是由于该转化子除了可产生高活力的外切-β-葡聚糖酶以外，还可以产生高活力的

木霉重组转化子是丝状真菌，菌落呈放射状扩散生长，采用刚果红染色法形成的染色带不明显。本文采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法相结合的方法筛选外切-β-葡聚糖酶高产转化子，操作简便，筛选周期短，结果直观、正确，显著提高了筛选效率。

2.3 重组转化子产酶试验结果

内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶（见图3、图4）。

以六株转化子72 h时的菌落直径d为x轴，48 h、72 h时C1酶活力为y轴，作图2。如图所示：里氏木霉转化子在MCC筛选平板上的生长速度与C1酶活力正相关，48 h时两者的线性关系更好，说明可以根据MCC筛选平板上菌落直径选择外切-β-葡聚糖酶活力较高的转化子。此实验结果支持了微

3.0

2.5

growth of transformants on MCC screening plates

2.4 重组转化子T. reesei ZU-101的产酶进程

重组转化子T. reesei ZU-101的产酶进程如图3和图4所示。从图3中可以看出：重组转化子滤纸酶活力和纤维二糖酶活力的变化规律与出发菌株相似，其中纤维二糖酶活力差别不明显，但重组转化子的滤纸酶活力明显提高，发酵120 h滤纸酶活力最高达7.35 I U·mL-1，比出发菌株提高了40%。这34.66

FPA/IU·mL-1

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0.7

-1

0.5

0.4

dm/mm

0.3

0.2

图2. MCC筛选平板上转化子生长速度与外切-β-葡聚糖酶活力的关系

Fig.2 Relationship between exo-β-glucanase activities and

t/h

cellobiase activity/IU·mL

-1

0.6

图3. T. reesei ZU-101号转化子和出发菌株产FPA和CB酶的时间进程

Fig.3 Time course of FPA and cellobiase production by T. reesei transformant ZU-101 and the original strain

900endo-?glucanases activity/U·mL-1

[***********]200

1525

enzymatic hydrolysis yield/%35

20

exo-?glucanases activity/U·mL-1

30

-1

cellulase/FPIU·g

t/h

10

图5. T. reesei ZU-101号转化子和出发菌株酶解玉米秸秆试验结果

Fig.5 Hydrolysis yield of pretreated corn stover by cellulase from T. reesei transformant ZU-101 and the original strain

图4. T.reesei ZU-101号转化子和出发菌株产CMC酶和C1酶的产酶进程

Fig.4 Time course of CMCas and C1 production by T. reesei transformant ZU-101 and the original strain

3 β-葡聚糖酶活力及滤纸酶活2.16 倍和1.62 倍。

（3）由于里氏木霉转化子的酶系组成得到了定向优化，外切-β-葡聚糖酶活力得到了有效增强，使得纤维素酶的协同降解性能得到了明显提高。当酶用量为20 FPIU·g-1底物时，玉米秸秆的酶解得率可达94.4%。 References

2.5 酶水解试验

将来自T. reesei ZU-101分别为每克底物5、10、15、20、25-1底物。

水解实验结果如图5。20 FPIU·g-1纤维素酶用量达到在本试验中，虽然滤纸酶、纤维二糖酶和木聚糖酶的比例相同，滤纸酶的用量也相同，但由于重组菌株纤维素酶系中外切-β-葡聚糖酶活力明显增高，对玉米秸秆纤维素的协同水解作用也得到增强，所以重组转化子纤维素酶的水解效率明显较高。在酶用量为20 FPIU·g-1时，反应48 h,酶解得率达到94.4%，该试验结果明显高于同类文献报道水平

[21、22、23]

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