植物抗冻蛋白研究进展
江西农业学报2009,21(10):112—114AetaA—cuhuraeJiangxi
植物抗冻蛋白研究进展
熊小文1,黄发泉2,黎毛毛3,芦明3,黄永兰3,万建林3‘
(1.江西省农业科学院农业信息研究所,江西南昌330200;2.汀.西省邓家埠嘲家级水稻原种场,江西余江335200;
3.江西省农业科学院水稻研究所,江西南昌330200;)
摘要:抗冻蛋白是一种能抑制冰晶生长的蛋白质或糖蛋白,自20世纪60年代发现以来,研究对象从极区鱼类、昆虫转移到植物材料上。抗冻蛋白包括抗冻糖蛋白、抗冻蛋白l、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ、抗冻蛋白Ⅳ。简要介绍了植物抗冻蛋白的生化特征、抗冻机制及其应用研究。
关键词:抗冻蛋白;生化特征;抗冻机制;基因工程
中图分类号:951文献标识码:A文章编号:11301—8581(2009)10—0112—03
lksearchAdvancesinPIantAntifreezeProtein
XIONGXiao—wen。,HUANGFa—quart2,LIMao—ma03,LUMing’,HUANG
Yong—lan’,WANJian—lin’’
(1.A鲥cultural
Information
Institute,JiangxiAcademyofA矛culturalSciences,Nanchang330200,China;
2.DengiiaTownRiceSeedExperimentStationofJiangxiProvince,Yujiang335200,China;
3.RiceResearch
Abstract:Antifreeze
Institute.JiangxiAcademyofAgriculturalScienees,Nanchang330200,China)
a
protein(AFP)is
in
kindofprotein
or
glyeoproteinwhich
CIt/I
inhibitthegrowthoficecrystals.Inlast3dec—
ades。ithasbeendiscoveredInthis
polafish,overwinteringinsectsandplants.ItincludesAFGP,AFPI,AFP11,AFPIIIandAFPIV.
as
paper,thebiochemicalcharacteristics,antifreezingmechanism
well
as
applicationsofantifreeze
proteins
werereviewed.
Keywords:Antifreezeproteins;Biochemicalcharacteristics;Antifreezingmechanism;Geneticengineering
抗冻蛋白是一类抑制冰晶生长的蛋白质,包括不含糖基的抗冻蛋白(AntifreezeProteins,AFPs)和含糖基的抗冻糖蛋白(AntifreezeGiycoproteins,AFGPs),具有3个基本特征。“,即热滞效应(Thermal
Hysteresis
Activity,
等。12o从常绿抗冻植物沙冬青(Ammopiptanthus
mo凡gti—
cw)叶片中分离得到了抗冻蛋白。卢存福等旧1在高山植物唐古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得抗冻蛋白,采用组织培养方法,低温诱导其愈伤组织产生抗冻蛋白也获得成功。1“。1998年,英国York大学的Worrall等|141发表了关于胡萝卜(Daucuscarota)AFPs及其基因
THA)、冰晶形态效应、重结晶抑制效应(RecrystallizationInhibition,RI)。对3类生物的AFPs分析表明,其化学结构、理化性质、空间构型均不同;同类生物之间的AFPs同源性也不高,几乎不存在相似性序列或结构模式,说明它们可能是在不同的有机体中独立进化而来,没有共同的演化规律、L“。
的论文,标志着第1个植物A肿基因的发现。2001年,
尹明安等成功克降了中国胡萝卜(var.sativus)和英国胡萝卜(var.autumn)的AFP基因。
2植物抗冻蛋白的抗冻机制及生化特性
植物AFPs属于冷诱导蛋白。从20世纪80年代开始,随着植物冷害及抗冷机理的研究,冷诱导蛋白(Cold
AcclimationInduction
1抗冻蛋白的种类
有关鱼类、昆虫AFPs的发现可以追溯到20世纪60年代’4jj,后来其研究对象慢慢扩大到细菌、真菌、无脊椎动物、脊椎动物、非维管植物和维管植物㈡1。迄今为止,对鱼类‘卜7I、昆虫一’8’9。的AFPs研究比较深入和系统,而植物AFPs则发现较晚’2川。
1992年,加拿大Griffith等第1次明确提出获得了植物内源AFPs。他们从经低温锻炼的能够忍受细胞外结冰的冬黑麦(Secalecereale)叶片质外体中得到并部分纯化了该蛋白。美国圣母大学的Duman实验室¨1。在多种植物中发现了具有热滞效应的蛋白质。1994年,费云标
收稿日期:2009—08一19
Protein.CAIP和ColdRegulatory
Protein,CORP)成为研究热点之一。在北印第安纳州研究的16种被子植物及常绿植物中,在秋、冬季均可检测
到AFPs,但在夏季则检测不到川,这表明抗冻蛋白是一类低温诱导蛋白质,是抗冻植物对冬季低温较普遍的适
应机制。AFPs的3个基本特性表明:在低温下,它与冰晶的形成直接相关,因此,它对植物的保护作用是直接
的;其它冷诱导蛋白只是间接调节酶或通过信号传导等
一系列温度适应来调节植物的抗寒性J7・培3。胡萝卜
基金项目:留学川同人员科研启动基金;转基因生物新品种培育科技重大专项一南方红黄壤区耐皿铁毒、铝毒转基因水稻新品种培育
(2009ZX08001—024B)。
作者简介:熊小文(1967一),女.江两南昌人,实验师,主要从事农业科技情撤研究。・通讯作者:万建林。
万方数据
10期熊小文等:植物抗冻蛋白研究进展
113
AFP基因在非冷驯化状态下不表达,冷驯化状态下表达水平迅速而特异性地提高一…。此外.转基因植物的AF.Ps通常只在低温(4℃)诱导下才能检测到其表达啪J。值得一提的是,AFPs具有亲水性和热稳定性,这也与冷诱导蛋白相似一J。
有关植物AFPs的理化性质,对欧白英(Solanum
d如amara)¨1121’圳和冬黑麦。10∞埘1的研究较多,沙冬
青¨2瑚刀1和胡萝卜mJ‘则有少量报道。
Huang等旧。从冬季欧白英中克隆得到一种热滞蛋
白基因s£幼一64,将其以融合基因的形式克隆于大肠杆
菌表达载体,得到了全长的热滞蛋白STHP一64。该蛋白与WRKY蛋白极为相似,有2个保守区域,每个区域含一个C—X。一C—X笠坷一H—xl—H锌指结构。WRKY蛋白在植物中是调节病原菌相关蛋白(PathogenRelatedProtein,PR)翻泽的重要因子,可能由于AFPs与抗病蛋白存在着某种联系。STHP一64的C端有10段连续的13一mer重复序列,这与某些动物抗冻蛋白相似。单独的STHP一64蛋白抗冻活性很低,但柠檬酸盐作为某些昆虫抗冻蛋白的活性增强剂,同样能提高其抗冻活性。
Yeh等口1在冷驯化的冬黑麦中发现有2种抗冻蛋白与几丁质酶CHT9、CHT46十分相似,分子质量分别为
31.7kDa和24.8kDa。抗冻蛋白、几丁质酶只在氨基酸
顺序上有少量的化学修饰,所以这2种冷诱导产生的具有冰结合活性的几丁质酶可能是基因复制的结果。Sidebottom等‘圳在过冬的多年生黑麦草(Loliumperenne)中分离出一种热稳定性极高的抗冻蛋白,能耐受100℃高温,其重结晶抑制活性相当高,按照摩尔浓度计算,其
滑|生约为大洋条鳕AFPllI的200倍,其热滞值(0.10~
0.45℃)远远低于鱼类(1.0—1.5oC)和昆虫(5~6℃)。傅里叶变换红外光谱分析表明,这种AFPs在溶液状态或与冰结合时,都呈现出13一折卺状,而胡萝卜AFPs及鱼类的AFPⅡ、AFPIH只在与冰结合时才呈现此构像。
从沙冬青叶片中分离得到的具热稳定性的AFPs,分子质量约为40kDa,pl为9.0,热滞值为0.9℃(20
ms/
mL),其中有糖蛋白瑚1,也有非糖蛋白旧“。在氨基酸组成上很难找到其同源性蛋白。测定其N端的20个氨基
酸序列,发现它与植物凝集素有73%的同源性,但由于
同源性比较仅仅是在20个氨基酸范围内进行,只占AF.Ps氨基酸的6%,所以两者的同源性有待进一步证实。
圆二色性(CD)分析表明,a一螺旋为1l%、反平行B一
折叠为34%、无规则线团为55%,这与某些鱼类AFPs的二级结构相似。沙冬青叶片粗提液中AFPs的热滞活性远远高于纯化液,但其机理尚不确定,一种可能的解释是
AFPs在体内与其它多种抗寒因子协同作用。
Worrall等¨41和Meyer等¨94发现胡萝卜AFPs富含亮氨酸,与多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturo-
nfl,se
InhibitorProteins,PGIPs)家族中的植物LRR(ku—
万方数据
cine—Rich—Repeat)蛋白有高度的同源性,可达50%一65%,但胡萝卜的AFPs提取液对多聚半乳糖醛酸酶(Po-
lygalaeturonaseProtein,PG)并没有抑制活性¨…。推测这
种新型的抗冻蛋白可能足从PGIP演化而来的。LRR蛋白是与病原菌防御体系相关的蛋白质,是病原体引发的配基的受体蛋白,同时与Of.一螺旋、B链的形成有关。AFPs在胡萝卜直根中冷诱导表达,其cDNA为1140bp,DNA为1238bp,编码332个氨基酸,成熟糖蛋白的分子量为36kDa,pI为5.0,热滞值为O.35℃,经酶切去糖侧链后并未影响其活性,这点与欧白英和鱼类的AFGP明显不同。在转基因拟南芥中,AFP基因的表达能够积累抗冻活性。尹明安等¨纠将克隆的中国胡萝卜和英国胡萝卜的AFP基因进行序列对比,在被测的1004个核苷酸中,有35个碱基不同,其中无义突变20个、有义突变15个,按有义突变计,同源性为98.5%。
从上述研究结果可以看出,植物AFPs可能具有双重功能,既有抗冻活性,又有酶(B—l、3葡聚糖酶、几丁质酶)、抗菌(如甜味蛋白、LRR蛋白、WRKY蛋白)、抗虫活性(植物凝集素),也可能只在同源性上说明他们之间存在某种联系¨4.27.…。
由于植物抗寒性是由多基因控制的,而且还与其它环境因子的胁迫发生交叉作用,这就增加了抗寒机制研究的复杂性。目前,这一领域的研究虽然已有新的进展,
但有关植物AFPs的生理生化性质、空间构型、作用机制仍不甚清楚。因此,有必要从不同植物中提取内源抗冻
蛋白,并对它们的结构、功能进行鉴定、比较分析,这样才有助于深入阐明抗冻蛋白的抗冻机制。
3植物抗冻蛋白的应用及展望
植物AFP具有诱人的应用前景,在食品的冰冻、储藏、运输和解冻等过程中均能抑制重结晶化,并能减少滴液以防止营养成分的损失。在医学上AFP可用于人和动物的卵、精子、胚胎或肝脏等器官的超低温保存,改善其冷冻质量。应用其抑制重结晶的性质,还可以进行选育转基因抗冻作物,扩大良种作物的种植范围,改善恶劣的环境气候,使其向有益人类的方向发展。在过去的几
年里,对抗冻蛋白和相关的基因及其分子遗传等进行了
广泛的研究【3…,随着植物内源A即基因的不断克隆成
功,有望在今后数年内通过转移植物内源AFP基因至重
要经济作物,增强作物的抗寒性,打破作物由于受寒冷影响而限制产量和产地的不利局面,进而提高农作物产量。
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