艰难梭菌毒素的研究进展_陈熔

文章编号：1001-8689(2016)04-0316-05

艰难梭菌毒素的研究进展

陈熔 吕晓菊*

(四川大学华西医院感染性疾病中心，成都 610041)

摘要：艰难梭菌是引起抗菌药物相关性腹泻和伪膜性结肠炎的主要致病菌，致病性主要是由毒素介导，所产生的毒素因导致肠道正常菌群失调，肠道黏膜的损伤而引起一系列与感染相关的临床症状。且近年来，艰难梭菌感染率逐年上升，尤其是高毒力菌株的出现，病死率也不断上升，已引起全世界的关注。因此，对艰难梭菌毒素相关研究进行综述，将为防治艰难梭菌感染提供依据。

关键词：艰难梭菌；毒素；分类；致病机制中图分类号：R978；R378 文献标志码：A

DOI:10.13461/j.cnki.cja.005715

Research progresss of Clostridium diffi cile toxin

Chen Rong and Lü Xiao-ju

(Center of Infection Diseases, West China Hospital, Sichuan Univesity, Chengdu 610041)

Abstract Clostridium diffi cile is a main pathogenic bacterium implicated in antibiotic-associated diarrhea and

pseudomembranous colitis by production of toxin which cause intestinal fl oral alteration, intestinal mucosa injury and a series of infection in clinic.Recently, hypervirulent strains have emerged rapidly and caused much more clostridium dif fi cile infection and fatality in all over the world. This paper presents a review on Clostridium diffi cile toxin and could provide basis for Clostridium diffi cile infection control.

Key words Clostridium diffi cile; Toxin; Classifi cation; Pathogenic mechanism

艰难梭菌最初是在1935年由Hall 和O'Tolle 发现，但直到1977年证实艰难梭菌与临床上长期使用某些抗菌药物引起的伪膜性结肠炎有关才备受关注。艰难梭菌是一种革兰阳性厌氧的芽孢梭菌，广泛存在于自然界中如土壤、水、沙等以及人和部分禽畜的粪便中，因其芽孢对多种抗生素及消毒剂有很强抵抗力，可在外界存活数周甚至数月。艰难梭菌属于条件致病菌，为正常健康人群的固有肠道菌群，约占3%以下，肠道其他益生菌可抑制其过度繁殖，并降解其产生的毒素，而未表现出致病性[1-2]。因此，长期以来人们认为艰难梭菌感染的发病率和病死率较低，近年来，由于广谱抗生素、免疫抑制剂或化疗

药物的应用，导致肠道菌群失调，艰难梭菌过度生长并释放毒素，并成为医院抗菌药物相关性腹泻的主要原因。特别是高毒力菌株BI/NAP1/027(限制性核酸分型为BI ，脉冲凝胶电泳分型为NAP1，核酸分型为027) 在北美和欧洲的爆发和流行，发病率、复发率和病死率明显增加，给治疗艰难梭菌感染带来了新的挑战，已引起全世界关注[3-4]。目前欧美很多国家已经把艰难梭菌列为法定传染病必报的监测病原体。本文就国内外艰难梭菌毒素致病相关研究、产毒性艰难梭菌感染的流行和防治予以简要综述。1 艰难梭菌毒素分类

艰难梭菌可产生6种毒素，包括毒素A(tcdA ) 、

收稿日期：2015-08-26

作者简介：陈熔，女，生于1981年，在读博士研究生。 *通讯作者，E-mail: [email protected]

毒素B(tcdB)、毒素C(tcdC)、毒素R(tcdR)、毒素E(tcdE)和二元毒素(CDT)，分别是由tcdA 、tcdB 、tcdC 、tcdR 、tcdE 和CDT 基因编码。其主要的毒力因子是毒素A(肠毒素，308kD) 和毒素B(细胞毒素，270kD) ，它们均属于大梭菌毒素家族成员(LCTs)，且结构相似(约有48%氨基酸序列一致) ，可分为4个区域：N-端葡糖基转移酶区、半胱氨酸酶区、中心移位区、C-端受体结合区[5]。tcdR 、tcdC 和tcdE 为3个附属基因，它们与tcdA 和tcdB 共同位于染色体基因组一个19.6kb 的致病决定区上(paLoc)，tcdR 和tcdC 为调节基因，TcdR 为RNA 聚合酶转录起始因子，约22.1kD ，在细菌生长的稳定期表达，与tcdA 和tcdB 上游的启动区结合，起正向调节毒素基因转录作用[6]。TcdC 约25.5kD ，为抗转录起始因子，在对数期高度表达，对tcdA 和tcdB 基因转录有负向调节作用。已有研究证明tcdC 基因碱基的突变和缺失可导致毒素A 和毒素B 分泌增加形成高毒力性菌株[6-7]。TcdE 约18.8kD ，是一种类似于“穿孔素”的膜孔蛋白，促进毒素从细胞内释放[6]。艰难梭菌二元毒素发现于1997年，直到近期被重视，临床上产毒性菌株约有6.4%可检测出。它属于二元ADP-核糖转移酶家族，由负责编码具有酶活性毒素的CDTa(48kD)和编码受体结合的CDTb(75kD)两部分组成，它们均位于6.2kB 的CDT 决定区(cdtloc)，此区还包含一个基因调节蛋白CDTR 。且与致病决定区(paLoc)分属于不同的基因区域。CDTa 的N 端包含5α-螺旋和8β-折叠，参与CDTb 的结合，C 端属于具有ADP-核糖转移酶活性的R-S-E 类，起催化作用。CDTb 结合部位分4区，N 端257氨基酸序列构成活化结构区I ，接着480氨基酸处构成区域II ，此区参与膜孔的形成，区域III 起寡聚作用，区域IV 参与受体结合[8]。CDTR 属于LytTR 反应调节因子家族，它可刺激CDT 的产生，CDT 产毒性严格受CDTR 的调节[9]。2 艰难梭菌的致病机制2. 1 毒素的致病机理

艰难梭菌要实现致病作用需要二个步骤：首先在肠道黏附繁殖产生毒素，其次毒素对肠道黏膜发挥病理作用。正常肠道菌群具有定植抗力可以抵御病原体黏附。但长期使用抗菌药物，定植抗力减弱，肠道微生物群以及代谢群均发生变化，导致肠道菌群失调，艰难梭菌易于黏附在肠道并释放毒素[10]。释放的毒素通过受体介导的内吞、移位、释放催化

区进入胞液，糖基化苏氨酸35/37使小分子Rho GTP酶失活，继而下游RhoA 、Rac1和Cdc42失活，从而导致细胞骨架和紧密连接破坏，细胞变圆，破裂，死亡[11]。其中毒素A 和毒素B 还可通过激活p38-MAPK ，增加炎症因子如IL-8的产生，启动一系列下游效应，如中性粒细胞趋化、血管扩张、组织水肿和细胞凋亡[12]。此外，毒素A 还可抑制wnt 信号通路，具有抗肿瘤作用[13]。Bezerra Lima等[14]在早期研究中分别向仓鼠和小鼠灌胃毒素A 和毒素B ，发现毒素A 可导致肠出血、腹泻和死亡，而毒素B 对仓鼠和小鼠无影响，但通过腹腔内注射方法，毒素A 和毒素B 均可导致死亡。因此，认为毒素A 具有肠毒素和细胞毒素，毒素B 只具有细胞毒素，且毒素B 具有一个更有效的自加工过程，使其细胞毒素是毒素A 的1000倍以上。但毒素B 要进入组织细胞发挥作用需要毒素A 破坏肠壁黏膜[15]。随着越来越多的研究发现，毒素B 也具有肠毒性，且在艰难梭菌感染致病过程中，毒素B 比毒素A 发挥作用更大，临床上也分离出只分泌毒素B 而不分泌毒素A 的致病艰难梭菌菌株，并与一些全身严重疾病发生有关[16]。在高毒力艰难梭菌菌株中还存在二元毒素CDT ，它被丝氨酸激活后，CDTb 被蛋白酶切为20kD 和75kD 两个片段，75kD 片段寡聚化后形成七聚体，与细胞表面受体(LSR)结合，CDTa 再与CDTb 相互作用，形成的复合物内吞进入胞质，在酸性条件下，CDTb 在内吞体膜上形成孔，CDTa 可通过孔释放到胞质，CDTa ADP-核糖转移酶可导致肌动蛋白细胞骨架解聚，从而形成微管，这些微管在上皮细胞交织成网，增加了艰难梭菌的黏附及定植[8]。既往在动物研究中表明，存在CDT 而无毒素A 和毒素B 时并不致病，推测CDT 可能只与疾病严重程度有关，又有研究发现CDT 的存在可能与tcdC 基因的缺失密切相关，但没有得到进一步证实，CDT 在疾病发生过程中具体扮演什么角色，目前尚不清楚，需进一步研究[17]。2. 2 毒素基因的调控

最近研究资料表明，毒素基因的表达除了正向调控的tcdR 和负向调控的tcdC ，还包括CodY 、Spo0A 、CcpA 、SlpA 、FbpA 、Cwp84、GroE1、sigD 和Flic 、FliD 等[18]。CodY 是许多革兰阳性菌中基因表达的全面调节蛋白，除直接调节芽孢形成，可与RNA 聚合酶全酶结合可促进tcdA 和tcdB 基因的表达[19]，它还可与tcdR 特异性结合，在营养不足时，tcdR 增

. 318 .

中国抗生素杂志2016年4月第41卷第4期

加，从而tcdA 和tcdB 基因表达增加；反之，在营养丰富时，tcdR 减少，进而抑制tcdA 和tcdB 基因表达[20]。Spo0A 作为艰难梭菌芽孢形成的调节因子也参与毒素基因的调节，它可在细菌生长的稳定早期负向调节毒素的合成[21]。研究表明CcpA 为调节新陈代谢和毒素基因的表达的连接点，在环境变化下，CcpA 可与CodY 协同毒素合成[22]。受第二信使C-di-GMP 调节的sigD 除调控鞭毛合成、运动以及营养自溶，对毒素合成也起正向调节作用[23-24]。此外，Darkoh 等最近研究发现附属基因调控的agr 群体感应系统也参与调节毒素基因合成[25]。3 毒素的检测

毒素的检测常包括：①产毒素细胞培养是检测艰难梭菌的毒素产生情况，并具有较高的敏感性和特异性。曾认为是“金标准”，但是因细胞培养技术难度较高，测定时间长，故在常规临床微生物实验室无法普及[26]；②毒素A 、B 的免疫学检测主要采用酶联免疫法、免疫层析法等。此法特异性较高，敏感性较差，且容易出现假阴性[27]；③毒素基因的实时荧光PCR 用RT-PCR 方法检测tcdA 和tcdB 基因，该法能快速特异性检测产毒株，但有假阳性的存在[28]。④乳胶凝集试验用艰难梭菌抗毒素与乳胶微粒交联，然后用抗原抗体结合产生的免疫沉淀来检测毒素。该法假阳性较高，且也存在假阴性，临床使用有一定缺点[29]。最近，Darkoh 等基于毒素A 和B 具有葡萄糖醛基转移酶活性，其天然底物UDP 葡萄糖与显色葡萄糖苷(PNPG)相似，通过检测后者可了解毒素的产生。此法具有较高的敏感性[30]。因各种检测法都有自身的优势和局限，许多研究者提出可联合检测方案。目前我国开展艰难梭菌毒素检测的医院较少，但产毒性艰难梭菌在我国也有流行趋势，应引起足够重视。

4 产毒性艰难梭菌流行情况

近年来，产毒性艰难梭菌在世界各地均有发现，但不同地区不同的菌株A 、B 毒素基因存在高变性[31]。感染不同的基因型与其病情严重程度相关。当前用于检测基因型的方法很多，如PCR-核糖体分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、多位点数量可变的末端重复序列分型(MLVA)等，目前常用的是PCR-核糖体分型。根据美国疾控中心报道艰难梭菌有150个PCR 核酸型，在北美和欧洲，自2000年来爆发流行过高毒力核酸分型027和078，而在亚

洲，027型只是偶发，在台湾偶见[32]。而亚洲主要为017、018、014、002和001，其中，在中国和韩国，核酸型017，A-B+，毒型VIII 广泛流行，在日本主要流行018型，香港以002型流行为主[33]。澳大利亚在2010年到2012年爆发流行244型[34]。5 产毒性艰难梭菌感染的防治

预防艰难梭菌感染主要是合理应用抗菌药物，特别提出是减少莫西沙星的使用，从而避免肠道菌群失调[35]。由于治疗艰难梭菌感染的传统药物甲硝唑和万古霉素已出现耐药，因此目前应从致病机制方面入手，具体如下：①应用粪便微生物群恢复肠道的定植抗力；②静脉注射直接针对毒素A 和B 的单克隆抗体；③抗毒素疫苗的应用[36]。6 小结

目前国内外针对艰难梭菌致病性的研究已有几十年历史，但对其致病机制仍有很多问题未解决，比如除了已发现的6种毒素，是否有其他毒素因子参与致病；还有些强毒株产毒素能力比流行菌株强，但形成芽孢能力弱，并不造成流行，这些均需要更深入的研究。随着研究地深入，也许可将艰难梭菌毒素应用到疾病治疗上，比如毒素A 具有抗肿瘤作用，可能会为癌症治疗带来新的途径。同时我们应充分认识到艰难梭菌感染的控制应重点在预防，合理应用抗生素，阻断艰难梭菌传播的多种途径。

参 考 文 献

[1] Barbut F, Jones G, Eckert C. Epidemiology and control of

Clostridium difficile infections in healthcare settings:an update[J]. Curr Opin Infect Dis, 2011, 24(4): 370-376. [2] Britton R A, Young V B. Role of the Intestinal Microbiota

in Resistance to Colonization by Clostridium difficle[J]. Gastroenterology , 2014, 146(6): 1547-1553.

cle infection[J]. Am [3] Heinlen L, Ballard J D. Clostridium diffi

J Med Sci, 2010, 340(3): 247-252.

[4] Camacho-Ortiz A, López-Barrera D, Hernández-García R,

et al. First report of Clostridium difficile NAP1/027 in a Mexican hospital[J]. PLoS One, 2015, 10(4): 1-10. cile [5] Rineh A, Kelso M J, Vatansever F, et al. Clostridium diffi

infection: molecular pathogenesis and novel therapeutics[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2014, 12(1): 131-150.

[6] Hunt J J, Ballard J D. Variations in virulence and molecular

biology among emerging strains of Clostridium diffi cile[J].

艰难梭菌毒素的研究进展 陈熔等

Microbiol Mol Biol Rev, 2013, 77(4): 567-581.

[7] Dupuy B, Govind R, Antunes A. Clostridium difficile

toxin synthesis is negatively regulated by TcdC[J]. J Med Microbiol , 2008, 57(6): 685-689.

[8] Gerding D N, Johnson S, Rupnik M, et al. Clostridium

dif fi cile binary toxin CDT: mechanism, epidemiology, and potential clinical importance[J]. Gut Microbes, 2014, 5(1): 15-27.

[9] Carter G P, Lyras D, Allen D L, et al. Binary toxin

production in Clostridium difficile is regulated by CdtR, a LytTR family response regulator[J]. J Bacteriol , 2007，189(20): 7290-7301.

[10] Theriot C M, Koenigsknecht M J, Carlson P E Jr, et al.

Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection[J]. Nat Commun, 2014, 7(20): 1-19.

cile [11] Rineh A, Kelso M J, Vatansever F, et al. Clostridium diffi

infection: molecular pathogenesis and novel therapeutics[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2014, 12(1): 131-1150. [12] Bobo L D, El Feghaly R E, Chen Y S, et al. MAPK-activated

protein kinase 2 contributes to Clostridium diffi cile-associated in fl ammation[J]. Infect Immun, 2013, 81(3): 713-722. [13] Lanis J M, Hightower L D, Shen A, et al. TcdB from

hypervirulent Clostridium difficile exhibits increased ef fi ciency of autoprocessing[J]. Mol Microbiol, 2012, 84(1): 66-76.

[14] Bezerra Lima B, Faria Fonseca B, da Graça Amado N, et

al . Clostridium difficile toxin A attenuates wnt/β-catenin signaling in intestinal epithelial cells[J]. Infect Immun, 2014, 82(7): 2680-2687.

[15] Keel M K, Songer J G. The distribution and density of

Clostridium diffi cile toxin receptors on the intestinal mucosa of neonatal pigs[J]. V et Pathol, 2007, 44(6): 814-822.

[16] Carter G P, Chakravorty A, Pham Nguyen T A, et

al . Defining the roles of TcdA and TcdB in localized gastrointestinal disease, systemic organ damage, and the host response during Clostridium difficile infections[J]. MBio , 2015, 6(3): 1-10.

[17] Kuehne S A, Collery M M, Kelly M L, et al. Importance

of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium diffi cile strain[J]. J Infect Dis, 2014, 209(1): 83-86. [18] Merrigan M M, Venugopal A, Roxas J L, et al. Surface-

. 319 .

layer protein A (SlpA) is a major contributor to host-cell adherence of Clostridium difficile[J]. PLoS One, 2013, 8(11): e78404.

[19] Dineen S S, Villapakkam A C, Nordman J T, et al.

Repression of Clostridium diffi cile toxin gene expression by CodY[J]. Mol Microbiol, 2007, 66(1): 206-219.

[20] Dineen S S, McBride S M, Sonenshein A L. Integration of

metabolism and virulence by Clostridium diffi cile CodY[J]. J Bacteriol, 2010, 192(20): 5350-5362.

[21] Mackin K E, Carter G P, Howarth P, et al. Spo0A

differentially regulates toxin production in evolutionarily diverse strains of Clostridium diffi cile[J]. PLoS One, 2013, 8(11): 1-16.

[22] Antunes A, Camiade E, Monot M, et al. Global

transcriptional control by glucose and carbon regulator CcpA in Clostridium difficile[J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40(21): 10701-10718.

[23] El Meouche I, Peltier J, Monot M, et al. Characterization

of the SigD regulon of C. difficile and its positive control of toxin production through the regulation of tcdR [J]. PLoS One , 2013, 8(12): 1-17.

[24] McKee R W, Mangalea M R, Purcell E B, et al. The second

messenger cyclic Di-GMP regulates Clostridium difficile toxin production by controlling expression of sigD [J]. J Bacteriol , 2013, 195(22): 5174-5185.

[25] Darkoh C, DuPont H L, Norris S J, et al. Toxin synthesis

by Clostridium difficile is regulated through quorum signaling[J]. MBio , 2015, 6(2): 1-14.

[26] Schu V, Green G A, Monteil H. Comparison of the ToxA

test with cytotoxicity assay and culture for the detection of Clostridium diffi cile-associated diarrhoea disease[J]. J Med Microbiol , 1994, 41(5): 316-318.

[27] René P, Frenette C P, Schiller I, et al. Comparison of eight

commercial enzyme immunoassays for the detection of Clostridium diffi cile from stool samples and effect of strain type[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2012, 73(1): 94-96. [28] Kim H, Jeong S H, Kim M, et al. Detection of Clostridium

dif fi cile toxin A/B genes by multiplex real-time PCR for the diagnosis of C. diffi cile infection[J]. J Med Microbiol, 2012, 61(2): 274-277.

[29] Reller M E, Lema C A, Perl T M, et al. Yield of stool

culture with isolate toxin testing versus a two-step algorithm

. 320 .

including stool toxin testing for detection of toxigenic Clostridium difficile[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(11): 3601-3605.

[30] Darkoh C, Kaplan H B, Dupont H L. Harnessing the

glucosyltransferase activities of Clostridium difficile for functional studies of toxins A and B[J]. J Clin Microbiol. 2011, 49(8): 2933-2941.

[31] Cheng Y, Du P, Chen C, et al. Toxin A-negative, toxin

B-positive Clostridium difficile infection diagnosed by polymerase chain reaction[J]. Infect Control Hosp Epidemiol , 2011, 32(5): 520-522.

[32] Liao T L, Lin C F, Chiou C S, et al. Clostridium difficile

PCR ribotype 027 Emerges in Taiwan[J]. Jpn J Infect Dis. 2015, 68(4): 338-340.

中国抗生素杂志2016年4月第41卷第4期

[33] Collins D A, Hawkey P M, Riley T V. Epidemiology of

Clostridium diffi cile infection in Asia[J]. Antimicrob Resist Infect Control, 2013, 2(1): 1-9.

[34] Eyre D W, Tracey L, Elliott B, et al. Emergence and spread

of predominantly community-onset Clostridium difficile PCR ribotype 244 infection in Australia, 2010 to 2012[J]. Euro Surveill, 2015, 20(10): 1-10.

[35] Wenisch J M, Equiluz-Bruck S, Fudel M, et al. Decreasing

Clostridium difficile infections by an antimicrobial stewardship program that reduces moxifloxacin use[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(9): 5079-5083. [36] Gerding D N. Clostridium difficile infection prevention:

biotherapeutics, immunologics, and vaccines[J]. Discov Med , 2012, 13(68): 75-83.