大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望

提取液后又进行了E L I S A 检测, 发现血清和粪便中有大量的抗原特异性I g G 及I g A 。值得一提的是, 喂食剂量为5m g 时所产生的免疫效果要比1m g 好得多, 这充分说明口服植物表达疫苗后所产生的免疫应答具有一定的剂量依赖性。4. 4　其他猪病疫苗

猪瘟、猪细小病毒病、猪伪狂犬病等均为国内常见的疾病, 每年给养猪业带来巨大的经济损失。国外有学者报道, 将猪瘟病毒的E 2糖蛋白基因分别转化到莴苣和苜蓿中, 给小鼠喂食植株叶片, 30d 后血清和粪便中的特异性I g G 和I g A 开始明显增多; 还有学者用烟草表达猪细小病毒的衣壳蛋白V P 2基因, 通过注射或口服均可使试验动物获得特异性抗体。在

[3]

国内, 肖少波等用烟草表达猪伪狂犬病毒保护性抗原g D 基因, 并证实了其抗原性。5　存在的问题

转基因植物的抗原蛋白表达量可达到5%,然而作为疫苗生产系统来说仍然是较低的水平, 因此进一步提高疫苗的表达量仍然是今后研究的一个重点。优化表达的方法有许多, 在研究出新的表达策略的同

时, 需要将各种方法有机地结合起来。另外, 转基因

植物的食用安全性问题一直是全球争论的焦点, 由于利用转基因植物表达的疫苗不属于转基因食品的范畴, 人们对此必然会产生疑虑甚至排斥。对于利用转基因植物表达动物疫苗的研究可先行一步, 待其形成成熟、稳定的产业化体系后, 再实现在人类疾病预防方面的应用。已有的研究结果表明, 对于猪的各类胃肠道传染病, 率先投放使用的可能性很大。科学家们也开始着手关于植物表达其他猪疫苗乃至寄生虫疫苗的研究。相信在不久的将来, 利用转基因植物表达的疫苗会成为防制各类猪疾病的强而有力的工具。参考文献:

[1]　BA R R YJL , J O S E P H M J , L Y L EK , e t a l .P l a n t -b a s e dv a c -c i n e s :un i q u e a d v a n t a g e s [J ]. V a c c i n e , 2001, 19:2742-2748. [2]　BA EJ L , L E EJ G , K A N GTJ , e t a l .I n d u c t i o no f a n t i g e n -s p e -c i f i cs y s t e m i ca n dm u c o s a l i m m u n er e s p o n s e sb yf e e d i n ga n i m a l s t r a n s g e n i c p l a n t s e x p r e s s i n gt h ea n t i g e n [J ].Va c c i n e , 2003, 21:4052-4058.

[3]　肖少波, 陈焕春, 方六荣, 等. 伪狂犬病毒g D 基因在转基因烟

草中的表达[J ]. 中国生物化学与分子生物学报, 2002, 18(4) :465-468.

(011)

大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望

余　波

1, 2

, 程安春

1, 3

, 汪铭书

1, 3

(1. 动物疫病与人类健康四川省重点实验室, 四川雅安625014; 2. 贵州省畜牧兽医研究所

贵州贵阳, 550005; 3. 四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心, 四川雅安625014) 中图分类号:S 852. 6

文献标识码:A

文章编号:1004-7034(2008) 10-0019-03

杆菌中的表达形式分为3种, 第1种为胞外分泌, 即

目的蛋白被分泌到培养基中, 这种方式表达的蛋白容易纯化, 不易被细菌蛋白酶裂解, 但大肠杆菌在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外; 第2种为周质空间表达, 这种方式表达的蛋白存在于周浆间隙中, 外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠, 在向外周质转移的过程中, 信号肽在细胞内剪切, 更有可能产生目的蛋白的天然N 末端; 第3种为胞内表达, 这种表达易形成无活性的包涵体, 需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。2　提高重组蛋白可溶性表达的方法2. 1　选择适合的载体与宿主菌

选用合适的载体与菌株结合可明显提高目的蛋白可溶部分的比例及活性。研究者通过在载体上融合一些自身溶解性高的多肽序列(或一些催化二硫键形成的酶) 和把信号肽序列引入表达载体来提高重组蛋白的溶解性或正确折叠。

　　大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统。但由于大肠杆菌表达系统所表达的蛋白常常形成无活性的包涵体, 为此研究者摸索出许多用来提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法, 近年来在提高重组蛋白可溶性表达的策略方面取得了一定进展, 现介绍如下。

1　重组蛋白在大肠杆菌中的表达形式

大肠杆菌被内膜和外膜隔开形成胞内、周质和胞外3个部分。根据表达部位的不同可将蛋白在大肠

收稿日期:2007-10-17; 修回日期:2007-12-20

基金项目:国家科技攻关重大项目(2004B A 901A 03) ; 教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目(N C E T-04-0906) ; 四川省基础研究项目(05J Y 029-109, 2006J 13-048) ; 四川省重点建设学科项目(S Z D 0418) 作者简介:余　波(1981-) , 男, 硕士. 通讯作者:程安春(1965-) , 男(布依族) , 教授, 博士, 博士生, , ,

时, 容易被宿主本身表达的蛋白酶降解。因此, 选择蛋白酶缺失的宿主菌非常有利于重组蛋白的表达, 尤其是重组蛋白的可溶性表达, B L 21(D E 3) 是最常用的表达菌。I g n a t o v a Z 等人用B L 21(D E 3) 作为重组青霉素酰胺酶的表达宿主菌, 结果比其他宿主菌的可溶性表达量高。重组蛋白在细菌细胞质中不能正确折叠的原因是大肠杆菌的细胞质呈还原环境, 不利于二硫键的形成。针对大肠杆菌的还原环境, 研究人员构建了缺失硫氧还蛋白还原酶基因的硫氧还蛋白还原酶缺陷株细菌, 降低细胞质还原状态, 以利于二硫键形成。如选用谷胱甘肽还原酶(g o r ) 突变的菌株或硫氧还蛋白还原酶(t r x B ) 突变的菌株, 将有助于制造次还原细胞质环境, 进而利于二硫键的形成。还有研究表明, 把合成外膜元件的基因突变菌株引到重组蛋白的表达中, 这样既可产生可溶性的具有正确空间结构的活性蛋白, 还可避免细胞壁在重组蛋白跨膜转运中的阻碍作用。如将L 型细菌(缺少细胞壁和胞周质) 作为青霉素酰基转移酶的表达宿主菌。2. 2　降低重组蛋白合成的速率

蛋白质动力学模型研究表明, 活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率。在高水平表达时, 新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此, 降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。常用的方法有降低培养温度、选择适当的启动子、使用较低浓度的诱导剂。降低培养温度有利于重组蛋白合成速率的降低, 因为在低温条件下细菌生长缓慢, 蛋白质合成也相应较慢, 新合成的蛋白质会有更充分的时间折叠。同时降低培养温度也能降低重组蛋白降解的速率, 提高重组蛋白的稳定性。降低培养温度虽能增加外源蛋白的可溶性, 但也有一个下限, 一般为8～10℃, 低于此温度, 大肠杆菌将停止生长, 蛋白也基本停止表达。

目前, 有许多启动子被应用于重组蛋白的表达, 启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。在胞内表达中, 常采用T 7、PL 等强启动子, 表达水平可达菌体总蛋白的10%～70%,重组蛋白多以包涵体形式存在。因此, 常采用强度较弱的l a c 等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。2. 3　改变培养基成分

培养基的组成对提高大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达有显著影响。首先, 保持培养基p H 值的稳定性对可溶蛋白的表达将产生重要影响, 需根据菌体和重组蛋白的特点选择合适的p H 值。p H 值距重组蛋白等电点越远, 表达的蛋白产物就越不容易形成包涵体。其次, 加入一些化学物质将对重组蛋白的可溶性, T r i t o n X-100、乙醇等。由于一些非代谢性糖类如山

梨糖醇、多元醇、蔗糖、甜菜碱的存在会增加培养基的渗透压, 进而可导致细胞质内渗透压防护剂的积累, 如甘氨酰–三甲铵乙内酯能抑制细胞质中重组蛋白的聚集, 从而提高可溶性蛋白的表达水平。

为了增加外膜的通透性, 研究者在培养基中添加了甘氨酸、Tr i t o n X-100, 这两种物质均能破坏细胞外膜的完整性, 改变细胞外膜的通透性, 且不引起明显的细菌裂解。唐金宝等人在培养基中添加终浓度为1%的T r i t o n X-100及1%的甘氨酸, 可使P r o Z Z –E G F P 基因在培养液中的可溶性表达量提高6倍。

另外, 杨军兰等人在培养基中加入乙醇, 能够抑制结核分枝杆菌M r 38000蛋白在大肠杆菌表达时的聚集, 促进其正确折叠形成可溶蛋白。由于乙醇是大肠杆菌热休克反应最强的诱导剂之一, 所以它在转录水平上刺激D n a K J 上调, 通过诱导D n a K 和D n a J 蛋白的表达促进重组蛋白的可溶性表达。2. 4　与分子伴侣或折叠酶共表达

分子伴侣是一类能帮助多肽链形成正确三维结构的蛋白质, 它主要通过阻止或校正出现不合理的疏水结合来帮助肽链的折叠。大肠杆菌的分子伴侣是由2个类型的蛋白质构成的, 分别是60k u 的H s p 60蛋白和10k u 的H s p 10蛋白, 二者都包含疏水区域, 这些区域可与未折叠或错误折叠的多肽链结合, 经过一个依赖A T P 的过程帮助蛋白正确折叠。研究发现, 与分子伴侣共表达可提高目的蛋白的可溶性, 并且如将几种分子伴侣同时表达, 有可能获得比单独使用更好的效果。值得一提的是, 共表达分子伴侣的选择应根据重组蛋白自身的特点进行。吴小阳等人将E R R C C 1基因与大肠杆菌G r o E L-E S 进行共表达。结果表明, G r o E L –E S 不能改善E R R C C 1基因在大肠杆菌中的可溶性。还有一个需要考虑的是培养温度, 温度可能会对共表达分子伴侣的效果产生重要的影响。H a nM X 等人将内皮他丁基因与分子伴侣G r o E L –E S 或D n a K –D n a J –G r p E 共表达, 并在16℃条件下培养, 结果可溶性蛋白的表达量增加。

D s b A 是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程的催化二硫键形成的折叠酶。D s b A 无论是在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加, 都能有效地催化蛋白质的折叠, 同时D s b A 还具有部分分子伴侣的活性。真核细胞的二硫键异构酶(P D I ) 也是一种常用的折叠酶。P D I 不仅是催化半胱氨酸氧化、二硫键异构化的高效酶, 而且还具有分子伴侣的活性。2. 5　通过替换氨基酸增加可溶性

蛋白质的一级结构即氨基酸序列, 是影响包涵体形成的一个重要因素。将蛋白质中的某个或几个氨,

动物麻醉的研究进展

胡崇伟, 于　枫, 李　静, 刘晓刚, 付彦涛, 高　利

(东北农业大学动物医学学院, 黑龙江哈尔滨150030)

中图分类号:S 857. 124

+

文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2008) 10-0021-02的安全性更高、苏醒更快, 成为新一代吸入麻醉药的

代表。1. 2　静脉麻醉

1872年, G r e 曾用水合氯醛静脉注射作全身麻醉; 1903年, F i s c h e r 和M e r i n g 合成巴比妥; 1909年, B i e r 用普鲁卡因作静脉麻醉产生镇痛作用; 1932年, L u n d y 报道用硫喷妥钠作静脉麻醉; 以后相继出现普尔安、羟丁酸钠、二甲基苯胺噻嗪、氯胺酮、乙醚脂、异丙酚等静脉注射的全身麻醉药。1908年, 在动物临床上将水合氯醛应用于马; 20世纪30年代, 又将巴比妥应用于犬和猫。目前, 临床研究得较多的麻醉药物是氯胺酮、巴比妥类药、α2受体激动剂和阿片受体类药, 并探索出一些较好的麻醉组合, 也取得了较满意的麻醉效果。1. 3　复合麻醉

复合麻醉是指同时或先后应用两种或两种以上的麻醉药物、麻醉方法及麻醉疗法的临床麻醉技术, 以达到满意的术中及术后镇痛效果, 为外科手术创造良好的条件, 确保病人或动物的安全和术后的顺利康复。其优点在于:麻醉用药剂量减少; 减少药物的不良反应; 满足手术操作的要求; 将麻醉对机体的不良反应降至最低程度; 提供完善的术后镇痛。

复合麻醉可分为吸入复合麻醉、静脉复合麻醉、肌肉复合麻醉、静吸复合麻醉、静肌复合麻醉等。在动物临床的麻醉中, 静脉复合麻醉多被用到科研方面; 吸入复合麻醉由于一次性投资大, 仪器操作复杂, 目前在国内很难推广。因此, 目前在动物临床上应用设计, 大大提高了重组蛋白的可溶性和活性。3　展望

随着对大肠杆菌表达机制的深入研究, 人们已开发出了许多提高重组蛋白可溶性表达的方法, 但由于蛋白质种类繁多、性质各异, 必须经过大量的试验才能选择到合适的宿主菌与载体, 表达出正确折叠、有生物活性的重组蛋白还需要不断地摸索。相信通过深入研究细菌的转运机制、蛋白折叠机制、蛋白降解机制和分子伴侣功能, 大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的技术将会越来越成熟。(011)

　　麻醉(a n e s t h e s i a ) 是指用药物或其他方法使病人

整体或局部暂时失去感觉与意识的支配, 以达到无痛的目的, 便于进行手术治疗。麻醉最早开始于公元前亚历山大时期, 那时人们只懂得用植物曼德拉草的汁液来减轻疼痛, 以后又逐渐发展到冷冻止痛、放血止痛和药物止痛等。在中国, 公元前2世纪汉朝伟大的医学家华佗发明了“麻沸散”, 并应用到外科手术中, 成为世界上第一个麻醉剂的研制使用者。1　麻醉方法的研究进展1. 1　吸入麻醉

1847年, 乙醚被用于马和犬的麻醉。自乙醚之后, 相继问世及应用于临床的挥发性麻醉药还有氯仿、氯乙烷、乙烯醚、三氯乙烷、氯烷、甲氧氟烷、安氟醚、异氟醚、七氟醚和地氟醚等。此外, 还有氧化亚氮、环丙烷、乙烯和氙气等气体麻醉药。由于麻醉药的性质及作用不同, 决定了它们在临床中的地位和应用, 如环丙烷、乙醚等麻醉药因易爆、易燃已被弃用。1956年, 氟烷被首次应用于临床, 之后发现其易引起氟烷相关性肝炎, 影响了它在人医临床中的应用, 而在动物临床上由于使用方便和价格低, 却得到了推广、普及。20世纪60年代, 有学者发现, 七氟醚和地氟醚在保留原有吸入麻醉药理想特性的基础上, 麻醉

收稿日期:2008-03-24

基金项目:东北农业大学博士科研启动基金项目作者简介:胡崇伟(1981-) , 男, 博士研究生.

通讯作者:高　利(1972-) , 男, 副教授, 博士, 硕士生导师.

可溶性。其可能的原因是突变后重组蛋白的疏水性发生变化或重组蛋白稳定性增加。J e n k i n s TM 等人将H I V-1整合酶的185位苯丙氨酸突变为赖氨酸、280位半胱氨酸突变为丝氨酸, 其核心区蛋白表达形式为可溶性表达, 且不影响整合酶的功能, 在没引入该突变且其他条件完全相同的情况下, 蛋白以包涵体形式表达。但这里要注意的是, 氨基酸的替换可能会对蛋白活性造成极大影响, 必须根据重组蛋白自身结构和活性特征进行替换。目前, 研究人员已开始根据计算机模拟的同源模型有针对性地对蛋白突变进行