淀粉酶米氏常数的测定
实验二 淀粉酶米氏常数的测定
一、目的要求
了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习和掌握米氏常数（Km ）及最大反
应速度（Vm ）的测定原理和方法，测出淀粉酶在以对淀粉为底物时的Km 和
Vm 值。
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
其中[S]Vm 为最大反应速度；Km 为米氏常数。
米氏常数Km 是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。
特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km 往往可以反映出酶与
各种底物的亲和力的强弱。
测定Km 和Vm ，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk 双倒数作
图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm，斜率为Km/ Vm。通过Lineweaver-Burk 作图法作图后可方便的求出Km 值。
三 实验材料、仪器和试剂
1．实验材料
淀粉酶购自国药集团医药有限公司。精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 U ／g 计) ，先用少量40℃蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml 容量瓶内，沉淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用。
2．仪器
比色管，试管25 mm×200 mm，平头移液管(可用磨去尖头的2mL 移液管制) ；刻度吸管5mI —(X1)，移液管20 mI；秒表，吸耳球(×1) ，电热恒温水浴锅，721型分光光度计。
3．试剂
(1)原碘浓 称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘—碘化钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。
(2)稀碘液 取原碘液2mL ，加碘化钾20 g，用蒸馏水定容至500 mL．贮于棕色瓶内。
(3)4％可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉4.000g （精确至0.001g ），用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL ，加热煮沸至透明，冷却后定容至100 mL, 此溶液现配现用。
(4)0.02mL pH 6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO 4. 12H 2O)45．23g 和柠檬酸(C6H 8O 7〃H 2O)8.07g ，用蒸馏水溶解定容至1000 mI用酸度计或pH 试纸校正pH 。
（5）0.1moL/L HCl
取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.43ml 加入已加有少量蒸馏水的50ml 容量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀即可。
四．操作方法
1. 淀粉浓度梯度标准曲线的制作
2. Km测定
在不同底物(可溶性淀粉) 浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）的反应体系中60℃反应5min ，测定酶的反应速度V(以单位时间内吸光度的减少量dA ／dt 来表示) ，以1／v-v[s]的双倒数法作图，计算Km 值。在比色管中加入不同底物(可溶性淀粉) 浓度（0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.0%）可溶性淀粉20mL ，缓冲液5mL ，摇匀后，在60℃水浴中平衡5 min，加入1.0 mL稀释好的酶液，立即记时，充分摇匀，准确反应5 min，立即取出1.00ml 反应液置入12.0ml 的0.1moL/L HCl中终止反应，然后立即取出1.00ml 溶液置于5.00ml 稀碘液显色，摇匀，并以稀碘液作对照，于660nm 处测定吸光度。
3. 数据处理
各管在722分光光度计测定波长660nm 的OD 值(OD660nm)。从淀粉标准曲线上查出OD660nm 相当于底物淀粉的含量(g/mL),计算出各种底物浓度下的初速度vo （单位以g ⋅mL -1⋅min -1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出淀粉酶催化淀粉水解的米氏常数Km 和最大反应速度Vm 。
六、 注意事项
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7. 取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH ，后加酶。 测定OD405时要以各自的空白调零点。 移液管或取液器的使用 比色杯的使用
七、思考题
(1) 试说明米氏常数Km 的物理意义和生物学意义。
(2)为什么说米氏常数Km 是酶的一个特征常数而Vm 则不是？