多种.植物总DNA提取方法及详细步骤

植物总DNA 提取

一、常用方法 改良CTAB 法（改良自精编分子植物基因工程，王关林，2002

SDS 法（植物基因工程，王关林，高盐低pH 值法（邹喻萍，植物生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用）

材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d ，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂：

(1) 2-巯基乙醇（2-ME ） (2) CTAB 抽提液 (3) CTAB/ NaCl溶液

(4) 24：1（V/V）氯仿/异戊醇 (5) CTAB 沉淀液 (6) 高盐TE 缓冲液 (7) 70％乙醇 (8) TE 缓冲液 操作：

(1) 称取样品0.2g ，去除表面的

DNA 污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。

(2) 将冻粉转入2ml 离心管中，

立即加入1000µl （980＋20）预热至65℃的CTAB 抽提

材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d ，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂： (1) 2×CTAB 提取缓冲液

操作： (1) 2ml 离心管中加入1ml 提取缓冲液，65℃预热。 (2) 取0.2g 新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。 (3) 将呈干粉状态的研磨物迅速转入提取缓冲液中，尽快混2002） 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d ，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂：

(1) 提取缓冲液：100mmol/L

Tris·Cl （pH8.0）、50mmol/L EDTA （pH8.0）、500 mmol/L NaCl 、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME ） (2) 10% SDS (3) 5mol/L KAC

操作： (1) 称取样品0.4g ，去除表面的DNA 污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。 (2) 将冻粉转入2ml 离心管中，加入提取缓冲液900µl （自注：观察此用量合适否），轻学报，1994） 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d ，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂：

(3) 提取缓冲液：100mmol/L

NaAC （pH 4.8）、50 mmol/L EDTA （pH 8.0）、500 mmol/L NaCl 、1.4％ SDS ，此种介质刚好为pH 5.5。

(4) 2.5mol/L KAc（pH 4.8）

操作：

(1) 称取样品0.4g ，去除表面的

DNA 污染，加入少许PVP40（相对分子质量为40 000）

置于研钵中与液氮共研成细粉。

(2) 迅速加入2ml 预热至65℃的

液，于65 ℃温育30min （10~60 min ），并经常温和混匀。

(3)

放至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心5min 。

(4)

将上清液转移至新的离心管中，加入1/10体积的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒充分混匀。

(5)

再次加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒使充分混合，于4℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心5min ，抽提至上清液澄清（界面无白色沉淀）。

(6)

将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的CTAB 沉淀液，颠倒混匀，室温放置15min 后（如果沉淀可见，继续做，否则于65 ℃温育30 min），于4℃，10000 r/min

匀，于65℃保温30min 。其

间轻柔混匀2~3次。

(4) 取出离心管，冷至室温，加

入1ml 的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静置10min 。 (5) 10 000r/min离心10 min。 (6) 转移上清液于另一离心管

中，加入2/3倍体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min 。

(7) 10 000r/min离心10 min，去

上清液。

(8) 用0.2ml 70％乙醇洗涤沉淀

1次，室温下微干，加入70µl 高盐TE 缓冲液和1 µl 的RNaseA ，颠倒混匀，37℃保温0.5h 。

(9) 加入2倍体积预冷的无水乙

醇，充分混匀，于4℃, 7 500g （对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心15min 。

(10) 将沉淀用70%乙醇清洗两次

后，晾干，加入50µl TE 溶解沉淀。 轻搅动，使冻粉充分散开。 提取缓冲液，保温30min ，(3) 加入400µl 10％SDS ，充分

并经常温和混匀（自注：观混匀，于65℃水浴中保温察时间够否，提取液够否）。 10～15min （间隔晃动2～3(3) 在室温下10 000g 离心

次）（自注：若裂解不充分可10min 。

延长时间）。

(4) 上清液中加入2/3体积

(4) 加入640µl 5 mol/L KAC，充

2.5mol/L pH4.8的KAc 溶分混匀，冰浴中放置30min 。 液，0℃放置30min 沉淀蛋白(5) 4℃ 12 000rpm离心15min 。 质。

(6) 上清液转入新的离心管中，

(5) 10 000g，4℃离心10min 。 加入等体积的氯仿/异戊醇，(6) 上清液加入0.6倍体积-20℃

轻轻颠倒离心管数次，放置预冷的异丙醇，温和混匀后5min 。

于-20℃放置30min 使核酸(7) 于4℃下8 000rpm 离心

充分沉淀。

10min 。

(7) 10 000g离心10min ，去上清，

(8) 上清液转入新的离心管中，

将沉淀溶于500µl SDDW 加入2/3体积、-20℃预冷的中。10 000g离心10min ，上异丙醇，混匀，放置30min ，清液转入新的离心管（去除观察DNA 沉淀生成。

不溶物）。

(9) 于4℃下8 000rpm 离心

(8) 加入0.6倍体积的-20℃预冷

10min ，去上清液。（自注：的异丙醇，温和混匀后于观察转速合适否）

-20℃放置30min 使核酸充(10) 用80％的乙醇洗涤沉淀，晾

分沉淀。10 000g离心10min 。 干10～15min 。

(9) 所得DNA 沉淀用80％乙醇

(11) 加入400µl TE缓冲液充分溶

洗涤后晾干。

解沉淀（若溶解不好，可置(10) 将沉淀溶解于50µl TE 中，

离心5min ，弃上清。

(7) 将残液尽可能除尽，加入

200µl 的高盐TE 缓冲液和2µl RNaseA 储备液重悬沉37℃水浴中保温，促进溶

解）。

(12) 5 000rpm离心5min ，上清液

转入新的离心管（去除不溶2µl RNaseA储备液，于37℃温育30min ，去除RNA 后可直接或经一次氯仿：异戊醇抽提后用于酶切及PCR 扩淀，于37℃温育30min 。 (8) 加入2倍体积预冷的无水乙

醇，充分混匀，于4℃, 7 500g （对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心15min 。

(9) 将沉淀用70%乙醇清洗两次

后，晾干，加入50µl TE 溶解沉淀。

自注：红色为与《精编》相比的 改动部分。

二、试剂配制

溶液名（配方来源） 组分浓度 RNaseA 2 000U/ml

物）。加入10µl RNaseA溶液（1µg/µl ），于37℃温育30min 。

(13) 加入等体积的氯仿/异戊醇，

混匀，放置5min 后10 000rpm 离心5min ，重复一次。

(14) 转移并量出上清液体积，置

新离心管中，加入1/5体积的3 mol/L NaAC，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，室温放置5min 。(15) 10 000rpm 离心5～10min ，

去上清。用80％乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。加入50µl TE 溶解DNA ，备用。

自注：根据原书按比例改变样品及试剂量

配法 待补

增。

用0.15mol/L NaCl，0.015 mol/L 1 mol/L Tris·Cl （pH8.0）（宝生物商品目录） 0.5mol/L EDTA（pH8.0）（宝生物商品目录）

TE 缓冲液pH8.0 （精编分子生物学实验指南）

高盐TE 缓冲液

柠檬酸三钠配成10mg/ml；使用前100℃热处理15min 除去残留的DNase 活性，DNA 沉淀溶解后加入1/100体积RNase 贮液。分装后-20℃备用。

1 mol/L Tris·Cl 0.5mol/L EDTA 10 mmol/L Tris·Cl ，pH8.0

1 mmol/L EDTA，pH8.0 10 mmol/L Tris·Cl ，pH8.0

称取12.11g Tris置于烧杯中， 加入约80ml ddH2O ，充分搅拌溶解

加入约4.2ml 浓HCl 溶液定容至100ml

高温高压灭菌后，室温保存

（应使溶液冷却至室温后再调定pH 值，因为Tris 溶液的pH 值随温度的变化差异

很大，温度每升高1℃，溶液的pH 值大约降低0.03个单位）

称取18.61g Na2EDTA·2H 2O ，置于烧杯中 加入约80ml 的ddH 2O ，充分搅拌溶解 用NaOH 调节pH 值至8.0（约2gNaOH ） （注意：pH 值至8.0时，EDTA 才能完全溶解）

溶液定容至100ml

高温高压灭菌后，室温保存 1 mol/L Tris·Cl （pH8.0）1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2ml ddH 2O 定容至100ml 1 mol/L Tris·Cl （pH8.0）1ml

（精编分子生物学实验指南） CTAB 抽提液 （精编分子生物学实验指南） CTAB/ NaCl溶液 （精编分子生物学实验指南）

CTAB 沉淀液 （精编分子生物学实验指南） 高盐低pH 值法提取缓冲液 2.5mol/L KAC（pH 4.8）

1 mmol/L EDTA，pH8.0 1 mol/L NaCl

于室温保存（可在几年内保持稳定）

2％（W/V）CTAB 100 mmol/L Tris·Cl ，pH8.0 20 mmol/L EDTA，pH8.0

1.4 mol/L NaCl

于室温保存（可在几年内保持稳定）

10％ CTAB 0.7 mol/L NaCl 1％（W/V）CTAB 50 mmol/L Tris·Cl ，pH8.0 10 mmol/L EDTA，pH8.0 于室温保存（可在几年内保持稳定）

100mmol/L NaAC（pH 4.8）、50 mmol/L EDTA （pH 8.0）、500

mmol/L NaCl 、1.4％ SDS ，此种介质刚好为pH 5.5

0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2ml NaCl 5.844g

ddH 2O 定容至100ml CTAB 2g 1 mol/L Tris·Cl （pH8.0）10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）4ml NaCl 8.1816g

在40ml H 2O 中溶解2.05g NaCl ，缓慢加入5g CTAB，同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容终体积至50ml 。自注：在烧杯中配制，不定容。

CTAB 1g 1 mol/L Tris·Cl （pH8.0）5ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）2ml

待补 冰乙酸调pH 称取14.7g 乙酸钾，溶于60mlddH 2O 中，

溶解后再加入5.75ml 冰乙酸，定容至100ml ，所得溶液称为2.5mol/L KAC，溶

液中含有1.5 mol/L的钾及2.5 mol/L的乙酸根。待验证

改进的饱和在无菌水配制的饱和NaCl 溶待补 NaCl-CTAB 溶液液中，加2％PVP ，充分溶解后，(Rogstad, 1992；潘晓华缓慢加入CTAB 粉末，加热搅等, 2004) 拌至溶解，直至溶液呈透明凝 胶状 （一般每升饱和NaCl 溶

液需加30～40g CTAB) ，冷却后，加EDTA(pH8.0)至50mmol/L及2％2-ME ，搅拌，分装至10ml 离心管中。

电泳缓冲液P602分子克隆 TEN 缓冲液P607 IPTG P612 X-galP614 乙酸钾 P613

三、实验设计 1、五种试材

A. 种苗叶片：种子萌发的幼苗叶片（暗培养1～2d ），称量，用灭菌双蒸水清洗后备用

B. 新鲜叶片：采自田间的新鲜叶片，称量，用灭菌双蒸水清洗后干燥，4℃的黑暗中饥饿1～2d

C. 干燥叶片：采自田间的新鲜叶片，称量，用灭菌双蒸水清洗后干燥，装入袋中，加入国产的二级变色硅胶干燥（至少10：1），室温备用。

D. -20保存：采自田间的新鲜叶片，称量，用灭菌双蒸水清洗后干燥，装入袋中，-20保存，备用。

E. 改进的饱和NaCl-CTAB 溶液保存：采自田间的新鲜叶片，称量，用灭菌双蒸水清洗后干燥，装入已盛有1ml 保存液的2ml 离心管中，4℃备用。

样品C~E保存15d 后用于提取。

2、以A 为起始材料，从CTAB 法、高盐低pH 值法中筛选高效的提取方法。 3、以B~E为试材，探讨可行的试材保存方法。 4、评价指标：紫外检测（纯度、浓度、得率）、电泳检测、酶切检测、RAPD 分析（可能没有条件作）