菌种的管理与操作技术_中国疾控

菌（毒）种的管理与操作技术

中国药品生物制品检定所 王国治 中国疾病预防控制中心 王秋娣

摘要：菌（毒）种及样品的运输、保管、在实验中的应用与操作，是生物安全实验室（微生物实验室）安全管理的重要方面，为保证实验室安全和实验操作者免受其害，本文论述了菌（毒）种的管理和监督系统文件制定、微生物操作技术规范、避免感染性物质进入人体的的措施和对意外事故的处理方法。

关键词：生物安全实验室，菌（毒）种管理，微生物操作技术，事故处理

保证生物安全实验室（微生物实验室）安全，对菌（毒）种及样品的运输、保藏、使用等方面的管理是重要内容之一。如何建立和执行有效的管理与监督制度、标准操作规程和实验室操作技术规范是该类实验室的重中之重。菌（毒）种的管理包括样品的运输、保藏、使用等方面的内容，而对管理而言则是保证生物安全实验室安全（包括微生物实验室）的重要内容之一。然而，菌（毒）种的管理应建立规范和严格的管理制度以及对该制度的有效监督，才能真正地防止在传染病防治、科学研究以及生物制品生产过程中造成菌（毒）种的扩散或遗失，同时可避免发生实验室感染或由其引起的相关传染病的传播事件；而规范的菌（毒）种的管理又可避免菌种在使用过程中发生不应出现的差错，同时保证菌毒种保藏的质量以确保试验结果的可靠性。

在日常的实际工作中可以发现：大多数的实验室将“传代过程”与“数量”合并于研究记录中的现象，或者是存在着记录的不完整性，而记录不正确的现象更是较为普遍。我们可以设想，如果在这一过程中缺少真正直接反应实际工作状况、独立的传代与销毁记录，将来则难以追踪培养物的去向，这会不利于研究单位的安全自查和上级有关单位的核查，那么国家级的督察也只能是形式上的监督作用，而事实上却无法真正确保生物安全实验室的安全。因此，要求生物安全实验室应根据所从事的实际工作性质来制定独立的菌（毒）种保藏、开启、传代至销毁的原始记录，其中，记录的内容应包括传代菌（毒）种来源、传代时间、传代数量、传代用途以及备注等；销毁记录应包括销毁方式、销毁物品明细表（培养物、实验用具等）、灭菌温度与时间（开始时间，达到温度时间，停止灭菌时间，取出时间）。当然，实验记录同时应有实验人与复核人并记录在案。另则，实验室负责人应对记录内容负责，上级主管检查人员以及国家督察人员应将该项

目作为重点检查的内容之一，并对整个检查过程进行认真而负责的督察，不应疏忽任何的点滴，严格地按照规范的管理制度执行，防止事故发生，为本单位和国家把好质量关和安全关。

一、菌(毒）种管理与监督系统的文件制定

为保证菌（毒）种管理体系能规范化制度化的正常运作，可以通过制定符合本单位实际情况的菌（毒）种管理及监督标准操作规范（SOP）也是非常必要的，该（SOP）主要内容包括：菌（毒）种管理与监督标准操作细则，其内容应包括：菌（毒）种接收（分离）标准操作细则（SOP）；种子批制备与质控标准操作细则（SOP）；菌（毒）种使用、保藏、分发标准操作细则（SOP）；菌（毒）种销毁标准操作细则（SOP）；菌（毒）种事故应急处理的标准操作细则（SOP）：菌（毒）种管理监督的标准操作细则（SOP）。而对应于各个细则可根据所研究的实际内容或实验要求，制定更为详细的每一种实验的独立操作细则，并为其设计相对应的规范化表格化的原始记录。以备日后各种验证和检查所需。

（一）菌（毒）种管理与监督标准操作细则对于总则的内容要包括菌（毒）种管理与监督的制定SOP的指导思想、各种实验内容SOP的形成与批准程序、主要内容提要以及全部SOP的目录、实施与监督。

1、菌（毒）种接收（分离）标准操作细则

菌（毒）种接收标准操作细则（SOP）要求内容包括:

① 接收(外购、赠送)审批与接收程序;

② 菌（毒）种来源、背景资料、接收样品检验的要求有原始记录:

③ 菌（毒）种外购(接受赠送)申请表；

④ 菌种来源,背景资料登记记录菌（毒）种入库登记表；

⑤ 外来菌种传代与检验记录菌（毒）种分离标准操作细则（SOP）取样程序;对菌种的来源,其背景资料的要求、样品的分离操作(如分离过程比较复杂的可分别书写各自独立的SOP)

2、菌（毒）种种子批制备与质控标准操作细则（SOP）。菌（毒）种种子批制备标准的操作细则（SOP）的内容应包括：

① 原代主代及工作种子批制备过程的各种工艺要求细则;

② 批准种子批发行使用程序,各过程还应制定相对应的实验原始记录。 需要注意的是：菌（毒）种种子批质控标准操作细则（SOP）应根据各菌（毒）

种的不同特性,制定相关的形态学、血清学、生化特性、免疫原性、纯菌或外源因子检查、核酸序列分析等检定方法与结果判定。这要求在各个过程中都应制定相对应的实验原始记录并保存在档。针对各项检定项目应制定相对应实验原始记录，并有检定结果的汇总表，种子批申请放行使用申请表与审批表等。

3、菌（毒）种使用、分发与保藏标准操作细则（SOP）。菌（毒）种使用、分发程序、菌（毒）种保藏方法的建立及验证，菌（毒种的备份制度、菌（毒）种定期稳定性检查制度。

①菌（毒）种出、入库登记表

②菌（毒）种使用申请表

③菌（毒）种保藏方法验证记录

④菌（毒）种定期稳定性检查记录

4、菌（毒）种灭活与销毁标准操作细则（SOP）。该标准操作细则应由菌（毒）种销毁申报审批程序、销毁菌（毒）种复核程序、销毁菌（毒）种灭活验证方案等组成。还应具备表格等的配套记录。①菌（毒）种销毁申报表

②菌（毒）种灭活与销毁记录

③销毁菌（毒）种灭活验证试验记录

5、菌（毒）种事故应急处理标准操作细则（SOP）。各相关使用单位应建立发生菌（毒）种丢失、破损或实验室发事故的应急处理办法等标准操作细则。①菌（毒）种备份制度②事故申报表及相关处理记录等报告6、菌（毒）种管理监督标准操作细则（SOP）。应要求各单位的生物安全部门必须重视菌（毒）种的管理监督事项，定期了解本单位的菌（毒）种保管、检定及使用情况的相关规定，并进行人员抽查考核制度，有效预防事故的发生。需建立以下记录与表格等文件化的监督标准。①制定现场抽查记录（表）

②制定人员考核记录（表）

③样品来源,背景资料登记记录

④菌(毒)种分离记录

⑤外来菌种传代与检验记录

⑥菌（毒）种入库或处理登记表

二、生物安全实验室微生物操作技术规范

在实验室内标本的操作:包括其采集、内部运输、接收和打开标本的方法正确与否，都会增加或造成相关人员发生实验室感染的危险性。因此，在进行感染性标本的操作时应注意以下问题：

（一）样品容器 样品容器的材料可以是玻璃的，但建议最好使用塑料制品为宜。样品容器本身要求坚固，并正确地用盖子或塞子盖好后应检查是否无泄漏。在容器外部不能有残留物。容器上应当正确地粘贴标签以便于识别。样品的要求或说明书不能卷在容器外面，而是要分开放置，最好能放置在防水的袋子里。样品在设施内的传递为了避免意外泄漏或溢出，应当使用盒子等二级容器，并将其固定在架子上使装有样品的容器保持直立状态。二级容器可以是金属或塑料制品，但应该可以耐高压灭菌或耐受化学消毒剂的要求。密封口最好有一个垫圈并要求定期地清除污染。

（二）样品接收 需要接收大量样品的实验室应当具备专门的房间或空间。众所周知，实验室事故、伤害以及与工作有关的实验室感染主要是由于人为失误、不良实验技术以及仪器使用不当而造成的，当实验室样品的收集以及内部传递和接收不当时，都能够带来相关人员感染的危险。应建立完善的管理制度与操作细则，避免或尽量减少这类问题或事故的发生。

（三）包装开启

作为接收和打开样品的工作人员应当了解样品对身体健康的潜在危害的知情权，要了解并接受过如何采用常规预防措施的培训，特别是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。样品的开启要在生物安全柜内进行，并准备好消毒剂。

（四）移液管和移液辅助器的使用

1、应使用移液辅助器，严禁用口吸取

2、所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染

3、不能向含有感染性物质的溶液中吹气

4、感染性物质不能够用移液管反复吹吸混合

5、不能将液体从移液管内用力吹出

6、刻度对应(Mark—to—mark)移液管不需要吹出最后一滴液体的比较安全，因此最好使用这种移液管，以避免发生不必要的事故。

7、污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。使用后的移液管应当在消毒剂中浸泡18或24小时后再进行处理。

8、盛放废弃移液管的容器应当放在生物安全柜内，直至高压灭菌后方能放置在外面。

9、固定有皮下注射针头的注射器不能够用于移液。应当用钝头导管替代针头使用。可以用工具打开瓶塞后再用移液管取样，从而避免使用注射器和针头。

10、为了避免感染性物质从移液管中意外滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的无纺布或吸有消毒液的纸，使用后将其高压灭菌或按感染性废物进行处理。

（五）避免感染性物质扩散的措施：1、在实验操作过程中为避免转移物质洒落，微生物接种环的直径应为2—3mm并完全封闭，手柄的长度应小于6cm以减小振动。或者采用一次性灭菌棉签。2、使用封闭式微型电加热器消毒接种环应避免在本生灯的明火上加热，否则容易引起感染性物质的爆溅。最好使用不需要进行再消毒的一次性接种环。3、为了避免产生气泡和气溶胶的扩散，不要在玻片上进行触酶试验，而应当采用试管、毛细管或盖玻片法。4、准备高压灭菌和或处理的废弃样品和培养物应当放置在防漏的容器内，如实验室废物袋。

5、在每一阶段的实验工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区域的污染。

（六）生物安全柜的使用

当出现溢出、破损或不良操作时，安全柜就将不再具备能保护操作者的功能应参考国家标准和相关文献，正确掌握生物安全柜的使用方法和了解其局限性。并应当建有书面的操作步骤、安全操作手册等，在使用中应注意以下事项：1、生物安全柜必须运行正常时才能使用。2、生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。3、安全柜内应仅放置本次实验所需的器材或样品，否则将阻碍后部的气流循环。样品在放人安全柜内的工作区前需要清除表面污染。4、安全柜内不能使用酒精灯，否则因燃烧而产生的热量会干扰柜内气流并有可能将过滤器烧坏，致使过滤器损坏。允许使用微型电加热器，但建议最好使用一次性无菌接种环。5、所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过观察挡板观看到。6、尽量减少操作者身后的人员流动，以免影响安全柜的气流。7、操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。8、实验记录、移液管以及其他物品不能够阻碍前面的空气格栅，因为这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。9、

工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。10、工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行5分钟。

三、避免感染性物质注入人体

（一）针头注射：1、通过认真练习和仔细操作，可以避免破碎玻璃器皿的意外刺伤。但建议在实验室尽可能的用塑料制品代替玻璃制品。2、皮下注射针头、玻璃吸管以及破碎的玻璃均可能将感染性物质注入体内。3、以下两点可以减少针刺事故： (a)注射时特别小心；(b)减少使用注射器和针头；（c）许多操作可用带有钝头导管的注射器替代。也可用一些简单的装置来打开瓶塞，然后使用吸管取样。4、不要重新给用过的针头戴护套。一次性注射器用完后，不必将针头从注射器上取下，应丢弃在防穿透的带盖容器中。5、应当用塑料吸管代替玻璃吸管。

（二）血清的分离：1、只有经过严格培训的人员才能进行这项工作。2、操作时应戴手套以及眼睛和黏膜的保护装置。3、规范的实验操作技术可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。4、移液管使用后应完全浸入次氯酸盐或其他适当的消毒液中。移液管应在消毒液中浸泡至少18小时，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。5、带有血凝块等的废弃样品管，在加盖后应当放在适当的防漏容器内高压灭菌和或焚烧。

6、为了清洗喷溅和溢出的血样，应当备有每天新鲜配制的次氯酸盐溶液。

四、意外事故的处理

（一）菌（毒）外溢在台面、地面和其他表面时的处理

1、戴手套，穿防护服，必要时需进行脸和眼睛防护。

2、用布或纸巾覆盖并吸收溢出物。

3、向纸巾上倾倒适当的消毒剂，并立即覆盖周围区域。通常可以使用5%漂白剂溶液（次氯酸钠溶液）；但在飞机上发生溢出时，则应该使用季铵盐类消毒剂，如苯扎溴铵等。

4、使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，向中心进行处理。

5、作用适当时间后（例如30 分钟），将所处理物质清理掉。如果含有碎玻璃或其他锐器，则要使用簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品，并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。

6、对溢出区域再次清洁并消毒（如有必要，重复第2～5步）。

7、将污染材料置于防漏、防穿透的废弃物处理容器中。

8、在成功消毒后，通知主管部门目前溢出区域的清除污染工作已经完成。

（二）菌（毒）外溢在防护服上

此时应立即进行局部消毒和更换。被污染的防护服要用消毒液浸泡后再进行高压灭菌处理。

（三）菌（毒）外溢到皮肤粘膜

在实验中发生菌（毒）外溢到皮肤粘膜的事故时，被视为有很大的危险存在，应立即停止工作，能用消毒液的部位可进行消毒，然后用水冲洗15～20min ，，处理后方能安全撤离。并视情况隔离观察，在此期间应当根据条件进行适当的预防治疗。

（四）皮肤刺伤

若发生皮肤被刺破时应被视为有极大危险，应立即停止工作，并对伤口进行挤血，用水冲洗消毒。并视情况隔离观察，其间根据条件进行适当的预防治疗。

（五）离心管发生破裂

1、非封闭离心桶的离心机内盛有潜在感染性物质的离心管发生破裂： ①如果机器正在运行时发生破裂或怀疑发生破裂，应关闭机器电源，停止后密闭离心筒至少30min ，使气溶胶沉积。

②如果机器停止后发现破裂，应立即将盖子盖上，并密闭至少30min 。发生这两种情况时都应报告实验室负责人。

③所有操作都应加强个人呼吸保护并戴结实的手套（如厚橡胶手套），必要时可在外面戴适当的一次性手套。

④当清理玻璃碎片时应当使用镊子，或用镊子夹着的棉花来进行。所有破碎的离心管、玻璃碎片、离心桶、十字轴和转子都应放在无腐蚀性的、已知对相关微生物具有杀灭活性的消毒剂内。未破损的带盖离心管应放在另一个有消毒剂的容器中，然后回收。离心机内腔应用适当浓度的同种消毒剂反复擦拭，然后用水冲洗并干燥。清理时所使用的全部材料都应按感染性废弃物处理。

2、在可封闭的离心桶（安全杯）内离心管发生破裂

所有密封离心桶都应在生物安全柜内装卸。如果怀疑在安全杯内发生破损，应该松开安全杯盖子并将离心桶高压灭菌。还可以采用化学方法消毒安全杯。

参考文献： Laboratory Biosafety Manual （WHO—第3版）