植物生理衰老指标

实验报告

课程名称：植物生理学及实验 指导老师：周启发 成绩：__________________ 实验名称：植物组织衰老的指标测定 实验类型：综合 同组学生姓名：朱张世昌 一、实验目的和要求（必填） 1. 掌握可溶性蛋白测定的原理；

2. 掌握植物组织中丙二醛的测定方法；

3. 掌握植物组织中超氧物岐化酶（SOD) 活性测定方法； 4. 了解植物衰老的原理。

二、实验内容和原理（必填）

（1）可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。在595nm 处有最大吸收峰。

（2）丙二醇的测定：MDA 在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物 该复合物最大吸收峰在532nm 处; 最小吸收峰600nm 处消光系数为155 (mM)-1 cm-1 （3）超氧物岐化酶（SOD) 活性测定原理： 四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：

核黄素受光照产生的O2.-能将NBT 还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm 波长有最大吸收, 而SOD 能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD 对O2.-的抑制率, 可以表征出SOD 含量。

三、主要仪器设备（必填） 材料：不同叶龄的同种植物叶片

试剂：磷酸缓冲溶液，考马斯亮蓝，TBA 与TCA 混合液、NBT 反应液 设备：分光光度计，高速离心器

四、操作方法和实验步骤 （1）可溶性蛋白测定：

称叶龄差异明显的叶片各0.5g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下（4度）离心10min ，其上清液即为蛋白提取液。取40μL 蛋白提取液和160μL 磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml 考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min ，用10mm 厚的比色杯在595nm 下比色读取OD 值 。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml 考马斯亮蓝溶液。 （2）丙二醇的测定：取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，加TBA 与TCA 混合液 4.0ml ，92ºC 水浴保温30min 空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA 混合液 4.0ml （92ºC 水浴30min ）比色，冷却后，平衡，离心5min; 5000g ，测定A532, A450和A600。

（3）超氧物岐化酶（SOD) 活性测定：称叶龄差异明显的叶片各1.0g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下离心10min ，其上清液即为酶提取液。在暗光条件下加入3mL NBT 反应液和100μL 酶提取液于试管中，在25℃照光（4000-10000lux) 并计

时,6-25min 后出现颜色变化， 9min 后测560nmOD 值。同时作空白实验。根据SOD 抑制NBT 光化学还原的量计算SOD 酶活性（unit/gFW)。一个酶活单位相当于引起3mL NBT 反应液达到50%抑制所需要的酶量。测定时用未照光NBT 反应液调零。

五、实验数据记录和处理

（1）称取取新老叶片各0.51g 。

六、实验结果与分析（必填） （1）可溶性蛋白测定：

由我们测得的数据可知，新叶吸光度为0.587，老叶吸光度为0.255，标准曲线为y=254.8x-3.965

则新叶蛋白质含量为145.6μg ，老叶蛋白质含量为61.0μg ，又称取0.51g 新老叶片，溶液稀释，所以新叶蛋白质含量为35.69mg/g，老叶蛋白质含量为14.95m g/g。 （2）丙二醇的测定：

蔗糖对MBA-TBA 反应有干扰，可用下式消除： MDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450

测得老叶中丙二醇含量为10.72µM ，新叶中丙二醇含量为0.1274µM ，经转换后可得老叶中105.10µM/g，

装

订

线

新叶中丙二醇含量为1.25µM/g。

（3）超氧物岐化酶（SOD) 活性测定：

SOD 活力（单位/mg蛋白）=（对照管OD 值-测定管OD 值）/对照管OD 值/0.5/加入粗酶液中的蛋白质含量

老叶SOD 活力（单位/mg蛋白）=10.36 新叶SOD 活力（单位/mg蛋白）=12.01

由测得数据可以看出，老叶的蛋白质含量少于新叶的蛋白质含量，而MDA 含量则高于新叶，证明衰老过程中蛋白质含量会减少，MDA 含量会升高, 超氧物岐化酶（SOD) 活性会下降。 七、讨论、心得

（1）激素与衰老的关系

叶片衰老是叶片发育的最后一个阶段, 叶片逐渐黄化, 并伴随着营养物质从老叶向新叶和种子转移的过程。

1、细胞分裂素：在叶片衰老过程中, 细胞分裂素含量逐渐减少, 因此被认为是叶片衰老起始信号之一(Gan和Amasino 1995)。人们通过外源喷施实验、转基因以及细胞分裂素相关突变体的研究, 在多种植物中证明了细胞分裂素对叶片衰老的延缓作用。

2、赤霉素：赤霉素活性成分含量在叶片衰老过程中逐渐变低, 外源施加赤霉素可以延缓叶片衰老进程, 而外源施加赤霉素延缓剂则能促进叶片衰老进程, 所以赤霉素被认为是一类延缓叶片衰老的激素(Yu等2009; Jibran 等2013) 。进一步的研究表明赤霉素不直接作用于叶片衰老, 而是通过拮抗脱落酸来延缓叶片衰老进程(Jibran等2013) 。

3、生长素：多项研究结果表明生长素在叶片衰老过程中是负调控激素。在叶片衰老过程中, 内源生长素含量提高2倍(Quirino等1999), 而外源喷施生长素可抑制衰老相关基因的表达(Noh和Amasino 1999), 表明生长素在叶片衰老过程中可能抑制衰老相关基因表达, 起到延缓衰老进程的作用。

4、乙烯：乙烯处理可以促进叶片和切花衰老, 而喷施乙烯抑制剂则延缓叶片和切花衰老, 表明乙烯正向调控植物衰老进程(Abeles1988)。转录组研究表明25%的乙烯合成和信号转导相关基因在叶片衰老过程中表达增加(Van der Graaff等2006), 亦说明乙烯在叶片衰老中的重要作用。

5、脱落酸：证据表明脱落酸也参与调控叶片衰老过程,Yang 等(2011b)发现NAC 转录因子VNI2的表达水平在叶片衰老过程中逐渐上升且受脱落酸和盐胁迫诱导, 该转录因子将响应胁迫的COR 、RD 等基因整合到衰老过程中去, 建立了脱落酸介导的胁迫信号和引发衰老的发育信号之间的关系。我们发现脱落酸诱导At NAP转录因子表达, At NAP转录因子则诱导编码蛋白质磷酸酶2C (PP2C)基因SAG113的表达, 控制衰老表型以及衰老过程中的水分丢失, 说明脱落酸在植物叶片衰老中的正调控作用(Zhang和Gan 2012; Zhang 等2012) 。

参考文献：张艳军等: 植物激素在叶片衰老中的作用机制研究进展

（2）第二次离心的目的何在？

往溶液中加入TBA 与TCA 混合液并保温之后，由于蛋白质等物质发生了反应，溶液中出现了不溶性的絮状沉淀。如果不离心，会造成测定吸光度时示数不稳定，难以读数，同时会引入较大的误差，因此需要二次离心，将沉淀与溶液分离开来。要注意测定吸光度时不要将沉淀倒入玻璃皿中。

（3）植物组织中那些物质对丙二醛测定（TBA 法）干扰较大？

丙二醛（MDA ）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。 测定植物体内丙二醛含量，通常利用TBA 在酸性条件下加热与MDA 反应，生成红棕色的三甲川，三甲川的最大吸收波长在532nm 。 由于植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，而且糖与TBA 显色反应产物的最大吸收波长在450nm 处，在532nm 处也有吸收，因此测定植物组织中MDA 与TBA 反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。 此外在

532nm 波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。在532nm 、600nm 和450nm 波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。

（4）研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温？

因为TBA 与MDA 的反应需要酸性和高温的条件，这样才能在532nm 处有最大光吸收。