海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度
第5卷第2期1998年6月
中国水产科学
JOURNALOFFISHERYSCIENCESOFCHINA
Vol.5No.2Jun.1998
海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度
袁有宪 曲克明 辛福言
(中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)
3
摘 要 本文通过正交试验,研究确定了铜、锌、锰、钴Chaeto2
cerosmulleri)和金藻(Isochrysisgalhana)(1～
(5～10)×(1～5)×5)×10-8、10-9、10-8、10---9-9。它们应用于牟氏角毛藻和金藻的培养,2014%～4312%和1917%～
2516%。,并对其他的五种元素的浓度进行了修订。f/配方基本相同;锰的浓度低约1个数量级;锌的浓度关键词 微量元素,单胞藻,海水养殖
海水育苗过程中,植物饵料特别是单细胞藻类的培养繁殖是育苗成功与否的关键环节之一。在单胞藻培养体系中,施用氮磷等常量元素提供了必要的营养来源,但随水体中原有的必需微量元素的消耗,微量元素将成为浮游植物生长繁殖的限制因素。在对虾养殖生产中,大多数放养者放苗前进行了施肥肥水,但所施的主要为氮肥和少量磷肥;另一方面,倘若缺少某些微量元素,不仅会导致浮游植物数量减少,也会造成浮游植物种群组成发生变化。一旦有益种群受到抑制,非有益种繁殖起来,将会导致养殖动物的营养不良或病害发生。
在农业、林业生产中,为补充土壤、水中微量元素的不足,从70年代开始就进行了微量元素肥料的研究,先后出现了种类繁多的微量元素肥料及多种施肥方式[1,2,4]。对海洋浮游植物而言,一般认为铁、铜、锌、锰、钼、钴、镍是必需微量元素[7,11];尽管人们认识微量元素对浮游植物的重要性已有较久的历史[3,9,10],但是作为养殖生产用的微量元素商品肥料尚未出现;另一方面,随海洋环境的变迁和养殖新品种的开发利用,对这些微量元素所需的浓度也在发生变化。所以,本文从海水中微量元素对海水育苗常用的两种单胞藻牟氏角毛藻(Chaetocerosmulleri)和金藻(Isochrysisgalhana)的必需性入手,研究了铜、锌、锰、钼、钴、镍在海水单胞藻培养液中的最佳浓度。1 材料与方法
收稿日期:1996-04-22
3中国水产科学研究院科研基金项目。
46
111 主要材料及试剂
中国水产科学 5卷
牟氏角毛藻和金藻藻种为本所环境保护研究室保存。实验用水取自青岛麦岛近海,盐度30～31,pH811。海水经沉淀、沙滤,装入聚乙烯塑料桶中备用。
硫酸铜(CuSO4・5H2O)、硫酸锌(ZnSO4・7H2O)、硫酸锰(MnSO4・H2O)、氯化钴(CoCl2・6H2O)、硫酸镍(NiSO4・6H2O)、钼酸钠(NaMoO7・2H2O)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。硝酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁、硅酸钠。所用试剂为分析纯或化学纯。112实验方法
在250ml三角烧瓶中,加适量海水,加入量根据藻种密度而定,使最终体积为200ml。营养盐浓度N∶P∶Fe(∶Si)为30∶2∶015(∶1)mg/L加一定量混合微量元素试验液,每组平行3个样。温度保持(24±1)℃。用4只并列40W日光灯为光源,光照为4000lx(光仪器厂产ZD-Ⅲ型照度计测量)。光照时间昼:夜为10:14动2～3次。每日取样计数,用UV-365自计分光光度计550nm处,用1cm比色皿以海水为参比测量吸光值,定用UV-365自计分光光度计,按文献[8]、锌、锰、钼、钴、镍的试验浓度,L(,并用方差分析评估实验结果。。
表 试验因子及水平
T1 Experimentalfactorsandtheirlevels
元素
ElementCuZnMn
110-910-910-9
水平/(mol・L-1) Level
210-810-810-8
35×10-810-7510-8
410-75×10-710-7
510-610-610-6
元素
ElementMoC0Ni
110-910-1010-10
水平/(mol・L-1) Level
210-810-910-9
35×10-810-810-8
410-710-710-7
510-610-610-6
2 实验结果211 正交试验结果
试验结果见表2、表3。以吸光度为评估指标,对所得的试验数据进行了直观分析。对角毛藻,各个因子水平Cu(2)、Zn(1)、Mn(3)、Mo(3)、Co(2)、Ni(2)最好;对金藻Cu(3)、Zn(1)、Mn(4)、Mo(2)、Co(4)、Ni(2)最好。F检验结果见表4、表5。结果表明,6种微量元素对角毛藻
影响作用的大小顺序为Cu>Mn>Zn>Ni>Co>Mo;对金藻为Cu>Mn>Ni>Mo>Zn>Co。
212 验证结果
为得到一种能够通用的微量元素配方并验证其正确性,本研究将角毛藻和金藻得到的最好水平分别配成配方1和配方2,并取得两组最好水平平均值配制成配方3(表6),分别用于角毛藻和金藻的培养实验。结果表明(表7、表8),对角毛藻,配方3明显好于配方1和2,生长至第4d时,细胞浓度提高818%;第8d时,提高1914%;第9d时,提高2014%。对金
藻,配方1和3好于配方2,生长至第7d时,使用配方3,细胞浓度提高1115%;第8d时,提高2912%;第10d时,提高4312%。但是使用配方1第10d提高了5218%。可以看出,使用配方1和使用配方3,在第8d前基本无差别。故配方3可以作为通用型配方使用。
表2 微量元素在角毛藻培养中的作用正交试验结果及直观分析
Table2 ResultsoforthogonaltestofmicroelementforC.mullericultureanddirectanalysis试验号
No.[***********][***********]425
Cu[***********][1**********]4
Zn[***********]512345
Mn[***********]51234
水平Levels
Mo[***********]45123
Co[***********]4512814
Ni[***********]223451210
吸光度A
角毛藻(第5d)
C.mulleri
(A-0.490)×1000-1146-2-1012730-5-4-10130-4987-18-2-11-36-87-45-18-35
T=-652
合计
-3390-16-40215772-29-[1**********]-1686317-72-2-20-90-259-189-103-93
[***********][***********][***********][***********][***********][***********]55
[***********][***********][***********][***********][***********][***********]450
[***********][***********][***********][***********][***********][***********]901472
-8140-21163830-4-31023-63320-1903-39-90-82-54-40
-1430-14-9-7127361-19-562310-350-12-15-82-62-31-18
Ⅰ/5Ⅱ/5Ⅲ/5Ⅳ/5Ⅴ/5
2110-8112-4310-5718-618-5114812
-016-3218-7412
1214-1214-4214-014
μ=T/75=-8.7
-2.0-20.8-10.8-59.6-48.0-35.6-146.8-66.8-412-26.8-0.2-15.8
213 对叶绿素合成的影响
表9是微量元素3种配方在室内生产规模培养单胞藻对叶绿素合成的影响的实验结果。可以看出,3种配方均不同程度地提高了牟氏角毛藻和金藻的叶绿素浓度。通用型配方(配方3)的使用效果与配方1和2基本无差别。
对表9中第6d的结果分析,用角毛藻筛选出的配方1提高角毛藻叶绿素浓度2516%,用金藻筛选出的配方(配方2)提高金藻叶绿素浓度2116%,通用型配方(配方3)对这两种藻的叶绿素分别提高1917%和2410%。
表3 微量元素在金藻培养中的作用正交试验结果及直观分析
Table3 ResultsoforthogonaltestofmicroelementforI.galbanacultureanddirectanalysis试验号
No.1
[***********][***********]24Ⅰ/5Ⅱ/5Ⅲ/5Ⅳ/5Ⅴ/5
Cu1
[***********]
Zn[***********]5
Mn[***********]3
水平Levels
Mo[**************]51
Co[***********]
Ni[***********]
吸光度A
金 藻(第6d)
I.galbana
(A-0.370)×10002
43-424-12--6-39025-6-18-171
-1544-3-8-7146326-4-15-164
-13-86-5504150-1-5-6-10-18-2-4-17-10-14合计
012-16-6-9-165-1-156220336-16-43-513----[***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][1**********]2.2-4.2-21.8-4.4-11.2-15.4-7.2-14.4-14.2-4.4-11.2-0.26.8-9.0-10.6-10.6-17.8-9.4-20.2-17.6-2.2-14.0-6.8-9.0-35.8-9.0-5.4-20.2-7.8-20.2
-12-8-20-17-7-9-14-17T=-271
μ=T/75=-3.6
表4 角毛藻-微量元素正交试验方差分析
Table4 VariantanalysisoforthogonaltestforC.mulleri
变异来源
总变异(SS总)
SCuSZnSMnSMoSCoSNiSD误
离均差平方和
[***********][**************]3
自由度
7444444450
均方
[***********]131530127
F显著性
[1**********]7.038.9211.1312.05
[1**********]3
F0.01(4,50)=3172,F0.05(4,50)=2.55
2期 袁有宪等:海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度49
表5 金藻-微量元素正交试验方差分析
Table5 VariantanalysisoforthogonaltesetforI.galbana
变异来源
Variantsource
离均差平方和
SS[***********]24379602
自由度
Freedom7444444450
均方
MS[**************]
F显著性
Significence
41.833.838.176.332.587.92
总变异(SS总)
SCuSZnSMnSMoSCoSNiSD误
3
3333
3333
33
F0.01(4,50)=3172,F0.05(4,50)=2.55
表6 Table6 Primary mol/L
元 素配方1(角毛藻C.m)配方())配方3(Formula3(all)
10-910-9
Mn5×10-8
Mo5×10-8
Co
Ni
EDTA
10-8
5×10-83×10-8
10-9 10-7
5×10-8
10-91113×10-810-92612×10-810-91811×10-8
10-7 10-8
10-9715×10-8215×10-8
表7 微量元素配方对角毛藻生长实验结果
Table7 EffectsofmicroelementongrowthofC.mulleri
生长天数/d Growthdays
配方
Formula123
1
2
4
6
8
9
细胞浓度/ml-1 Cellconcentration
8619±0108611±0109012±0108619±010
16616±01717319±11517818±01017319±010
23918±31225610±01727017±01024817±010
30615±51633117±51635218±31230516±1514
38914±101542217±71244515±131737311±4016
44311±291245513±31247916±71238913±4514
对 照Control
123
010-019318
提高率/% Raiserate-[***********]
-0138151514
[1**********]
[1**********]4
50中国水产科学 5卷
表8 微量元素配方对金藻生长实验结果
Table8 EffectsofmicroelementongrowthofI.galbana
生长天数 Growthdays
配方
Formula123
2
4
6
7
8
10
细胞浓度/ml-1 Cellconcentration
31318±41831416±51231810±71731219±611
013116318
52010±91851117±71951311±91050717±915
214018111
59219±101559118±71858911±313
65916±111365319±81465912±1014
74610±21565917±91074219±141657511±1316
2917141712
85410±141966718±161780010±301755818±2717
[1**********]2
对 照Control
123
56716±21759114±413提高率 Raiserate(%)
415413318
111511155
表9 Table9 Effectsofchlorophll-a μg/L
天数/d Days
配方1-角毛藻C.配方-配方33-C.mulleri配方3-3-I.galbara对照-角毛藻Control-C.mulleri对照-金藻Control-I.galbara
[***********][1**********]4
[***********][1**********]86
[***********][1**********]54
[***********][1**********]87
[***********][1**********]50
[***********][1**********]08
3 讨论
从实验结果可以看出,铜、锌、锰、钼、钴、镍等6种元素,对角毛藻和金藻都是必需的微量元素,这与文献[7,11]报道是一致的。但是,Guillar和Ryther[10]提出的著名的M-f/2配方(表10)中没有镍,根据本文结果,镍对单胞藻的必需性是显著的。比较本研究的配方和M-f/2配方,钴的浓度完全相同;铜、钼的浓度基本相同。本配方锰的浓度比M-f/2配方低近1个数量级,锌低约2个数量级。分析存在差异的原因,一方面是由于试验所用的单胞藻种类不同,因为不同种类的藻类对水化学环境的需求是不尽相同的;另一方面,所用的海水取自不同海域和历史时期,海水中痕量元素的浓度会有很大差别。随海洋重金属污染的加剧,同一海域不同历史时期的海水亦存在差异。本文采用的是青岛麦岛近岸海水,锌的浓度为(114～1912)×10-8mol/L,铜为(015～315)×10-8mol/L[6],钴为815×10-9mol/L[5]。与本研究配方比较,海水中铜在同一数量级,某些区域的海水还要低,故需要添加。
海水中钴的浓度较本配方低约一个数量级,也需要添加。海水中锌的浓度远高于配方,故需要量很低,但海水锌浓度与M-f/2配方的浓度一致,也就是说,并非本配方不需要锌或需要量很低,而是所用海水锌的量已经足够。关于锰的浓度,本配方比M-f/2配方低近1个数量级,分析原因,可能是由于M-f/2配方中铁的浓度较低(110×10-6mol/L),本配方铁的浓度为819×10-6mol/L,而铁在某些生化功能上与锰有相同作用[11]。总之,除M-f/2没有涉及镍外,可以认为本研究的配方和M-f/2配方基本一致,即不同种类的单胞藻对微量元素的需求浓度大致是相同的。但随历史的变化,海洋化学环境也在发生变化,某一区域
2期 袁有宪等:海水单胞藻培养液中微量元素的最佳浓度51
变化可能还是较大的,所以在藻类培养液中添加微量元素的浓度应视所用海水的背景值而定。当前易发生污染的元素主要有锌、铅、镉、铬、铜等,在研究微量元素的作用和单胞藻生产时需引起注意。
表10 微量元素配方与M-f/2配方比较
Table10 ComparisonofmicroelementcompositionwithandM-f/2
配方
Formula
Cu
Zn10-98×10-8
Mn715×10-89×10-7
Mo215×10-83×10-8
Co5×10-85×10-8
Ni10-9-EDTA1811×10-8
10-6
元素及浓度/(mol・L-1)Elementandconcentration
通用型
M-f/2
3×10-84×10-8
通过以上讨论可以认为,,并根
据目前海水环境条件修订了其他元素的浓度。
参 考[1] 王泽民.微量元素肥料概述.,2[2] 邢恩荣等.,2:31～34
[3] 朱树屏等..水产学报,1964,1:19～38[4],..中国农业科学,1989,22(4):58～64
[5] ,.(增敏)络合体系的高效液相色谱研究Ⅶ.用Me-TAMB-TritonX-100法测定天然水
.海洋与湖沼,1991,22(1):63～68
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[9] ChuSP.Theutilizationoforgannicphosphorousbyphtoplankton.JMarBiolAssocU.K.1946,26:285～295[10] Guillard,RRL.,JHRyther.Studiesofmarineplanktonicdiatom.I.Cyclotellananahustedtanddetonulaconfervacea
(cleve)granJCanadofMicrobio.1962,8:229～238
[11] SundaWG.Tracemetalinteractionswithmarinephytoplankton.BiolOceanogr,1990,6:411～442
Optimumconcentrationofmicroelements
inseawaterculturesolutionofmarinealgaeculture
YuanYouxian QuKeming XinFuyan
(YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071)
Abstract Copper,zinc,manganese,molybdenum,cobaltandnickelweredefinedasessential
elementsincultureofdiatomChaetocerosmulleriandIsochrysisgalbanaandtheiroptimumconcentrationsweredefinedas(1～5)×10-8mol/LCu,10-9mol/LZn,(5～10)×10-8mol/LMn,(1～5)×10-8mol/LMo,10-7～10-9mol/LCoand10-9mol/LNi,whenthosemi2croelementswereaddedintheculturalsolution,theconcentrationsofcellandchlorophyllofChaetocerosmulleriandIsochrysisgalbanawereraisedby20.4%～43.2%and19.7%～25.6%,respectively.ComparedwiththecompositionofseawatermediumM-f/2,thiscultureso2lutioncontainedanewadditionalelementNiandtheconcentrationsofotherfiveelementswererevised.TheconcentrationsofCo,CuandMowerethesamelevelasM-f/2.Theconcentra2tionofMnwas10timesaslowasthatinM-f/2.TheconcentrationofZnwas100timesaslowasthatinM-f/2approximately.Keywords Microelement,Marineunicellularalgae,Marineculture