氢谱在甾醇类化合物定量和纯度分析中的应用
分析化学(FE NXI H UAX UE ) 研究简报第12期
2003年12月Chinese Journal of Analytical Chemistry 1493～1495第31卷
氢谱在甾醇类化合物定量和纯度分析中的应用
薛 松 胡皆汉 张 卫 虞星炬 袁 权
(中国科学院大连化学物理研究所, 大连116023)
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摘 要 用1H NMR 谱可定量确定繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve ) 中分离得到的结构类似的甾醇类化合物的含量, 这种方法是对鉴定分析组成复杂而性质很相近的天然甾醇化合物的新思路。关键词 氢谱, 色谱, 定量, 甾醇, 海绵, 繁茂膜海绵
1 引 言
甾类化合物在动植物体中有广泛的分布, 种类繁多。一些甾类化合物在体内的含量较高, 属于生物
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膜上的功能化合物, 它们能插入膜上的磷脂中, 可以影响膜的流动性。其它低含量物质被认为是次级代谢产物, 在体内起一些特殊的作用。同一生物体中会含有结构非常类似的甾类的同系物及其衍生2
物。很多结构相近的甾类化合物物理、化学性质非常接近, 分离纯化很困难。海绵中含有组成复杂而结构又非常相似的甾醇化合物, 通常难以用单一的层析法逐一分离、解析, G C ΠMS 技术的联用被认为是
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对复杂的微量甾醇混合物进行鉴定分离的有效方法。人们用这种方法已鉴定出许多种甾醇类化合物。但尽管如此, 当分离得到一个二组分的混合物时, 如胆甾烷醇和胆甾醇, 由于二者性质相似, 在G C 谱中两物质的保留时间非常接近, 当胆甾醇含量较低时, 只得到一个胆甾烷醇的峰, 难以定量鉴定。但
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由于胆甾醇中存在一个双键, 而胆甾烷醇中没有, 利用H NMR 谱则可将双键中的H 检测到。
我们在研究黄渤海繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve ) 中的天然产物时, 通过G C ΠMS 、NMR 、IR 等分析
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技术, 鉴定出繁茂膜海绵中主要的甾醇为胆甾烷醇(C 27H 48O ) Ⅰ, 从H NMR 谱以及C NMR 谱中分析得到另一化合物胆甾醇(C 27H 46O ) Ⅱ。
2 实验部分
2. 1 仪器
气相色谱2质谱分析用Agilent 6890型G C System 与Agilent 5973Mass Selective Detector 联用仪。色谱柱为HP 25柱(0. 25mm ×30m ) 。色谱分离条件:程序升温50～250℃,20℃Πmin ;250～300℃,4℃Πmin , 300℃保持1min 。EI 70eV 。核磁共振谱用Bruker DRX 2400NMR 核磁共振仪测定(内标为T MS , 溶剂为
) 。红外光谱用Bruker E QUI NOX 55型红外光谱仪测定(K C DCl 3, 温度为22℃Br 压片) 。2. 2 海绵甾醇化合物的提取分离
采自中国大连周边的黄渤海水域的繁茂膜海绵, 经冷冻干燥, 获得海绵样品。经甲醇提取, 减压浓
缩, 再用氯仿萃取, 上硅胶柱分离, 分离采用梯度洗脱液。当洗脱液从30%氯仿Π环己烷变化到70%氯仿Π环己烷所获得的洗脱物经丙酮重结晶得固体物。
3 结果与讨论
在G C 2MS 图中得到一个峰, 经NMR 、IR 、MS 以及相关的文献和标准谱图, 确定其为胆甾烷醇的峰(保留时间为21. 6min ) , 见图1。而在NMR 谱图中可以看到有与胆甾烷醇结构类似的微量化合物存在, 113
δ141处的C 为在H NMR 中δ5. 35处有与双键相连的H (图2) , 同时在C NMR 谱中得到证实, 在δ121、
双键的两个C , 分析其应为胆甾醇(图3) 。在胆甾烷醇(C 27H 48O ) Ⅰ和胆甾醇(C 27H 46O ) Ⅱ的混合物的H 所对应的峰可以作为化合物Ⅱ的特征峰, δ3. 5～3. 6处的一个峰, 可
2002210217收稿;2003204204接受
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1494分析化学第31卷
ββ 图1 52cholestan 232和cholesterol 混合物的G C ΠMS 图
Fig. 1 G as chromatography Πmass spectrometry (G C ΠMS )
ββ 图2 52cholestan 232Ol 和cholesterol 混合物在C DCl 3中的1H NMR 谱图
Fig. 2 1H 2Nuclear magentic res onance (NMR ) spectrum of
ββspectrum of 52cholestan 232O L and cholesterol mixture in
C DCl
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ββ52cholestan 232Ol and cholesterol mixture in C DCl 3
以作为Ⅰ的特征峰(化合物Ⅱ中相应的H 在靠近δ3. 5处也有峰, 但这两个峰有所区别, 基本分开, 积分时不积Ⅱ在此处产生的峰, 但此处积分会产生误差) 。见表1。
表1 胆甾烷醇与胆甾醇的1H NMR 谱中的数据
ββT able 1 The data of 52cholestan 232Ol and cholesterol in 1H
nuclear magnetic res onance (NMR ) spectra
胆甾烷醇(C 27H 48O ) Ⅰ胆甾醇(C 27H 46O ) Ⅱββ5
2
choestan 232Ol cholesterol
结构式
S tructure
ββ 图3 52cholestan 232Ol 和cholesterol 混合物在C DCl 3中的13C NMR 图
3. 5～3. 61(H 3)
A 1=1
5. 351(H 3) A 2=0. 227
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Fig. 3 C 2Nuclear magnetic res onance (NMR ) spectrum of
δ(×10-6)
H 的个数Number of H 峰面积(A ) Peak area
ββ52cholestan 232Ol and
cholesterol mixture in C DCl 3
混合物中胆甾醇与胆甾烷醇的摩尔百分比可以用下式计算。
a =
A 2A 1+A 2
=
×100%=18. 51%
1+0. 227
表2中所列的数据为几次分离纯化得到的以胆甾烷醇为主成分, 另一成分为胆甾醇的几个样品, 所有样品通过G C ΠMS 无法检测到胆甾醇的存在, 但在NMR 谱中可以检测到该化合物的存在并对其含量进行估算。
表2 胆甾烷醇与胆甾醇的1H NMR 谱中特征峰的面积及Ⅱ在混合晶体中的含量
ββT able 2 Characteristic peaks of 52cholestan 232Ol and cholesterol in 1H NMR spectra and content of cholesterol in mixture crystal
样品编号
Sam ple 1234
A Β
A Χ
(δ3. 59)
1111
(δ5. 35) 0. 22700. 21680. 049050. 2760
a %
样品编号
Sam ple 567
A ΒA Χ
(δ3. 59)
111
(δ5. 35) 0. 23500. 36980. 3540
a (%)
18. 5117. 824. 6821. 63
19. 0327. 0026. 14
另外, 同样的方法发现了另一个低含量的甾醇衍生物的存在。在研究25%氯仿Π环己烷的洗脱物时, 在G C ΠMS 谱中仅发现了乙酰胆甾烷醇, 该组分在C NMR 和H NMR 谱中得到证实。但在H NMR 谱中
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1
1
第12期薛 松等:氢谱在甾醇类化合物定量和纯度分析中的应用14 95
发现了乙酰胆甾醇的存在, 见表3。据计算, 乙酰胆甾醇在该混合物样品中含量为14%。
表3 乙酰胆甾烷醇与乙酰胆甾醇的1H NMR 谱中特征峰的面积及乙酰胆甾醇在混合晶体中的含量ββ2cholestan 232Ol acetate and cholesterol acetate in 1H NMR spectra and content of cholesterol acetate T able 3 Characteristic peaks of 5
in mixture crystal
ββ5
2
Cholestan 232Ol acetate
结构式
S tructure
乙酰胆甾烷醇乙酰胆甾醇
Cholesterol acetate
δ(×10-6)
H 的个数Number of H 峰面积(A ) Peak area
1
4. 691(H ) A =1
3
4. 631(H 3)
A =0. 163
总之, 结合H NMR 谱来确定甾醇类混合物纯度的方法, 补充了用G C ΠMS 、HP LC 定性和定量的不足。在研究天然产物时, 由于某些结构类似、化学性质相近的分离纯化较难, 往往得到的是混合样品。为了降低纯化的成本, 快速获得混合物中天然产物的结构, 可应用NMR 谱图, 既作定性的结构确定, 又作定
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量确定。但当混合物中某一成分含量较少, 在H NMR 谱中特征峰较小时, 积分的误差将成为定量的最大问题, 有待解决。
致谢 感谢中国科学院海洋研究所李锦和研究员对于繁茂膜海绵的种属鉴定。R eferences
1 Zhang Huozhong (张豁中) , Wen Y ulin (温玉麟) . Activity Natural Products from Animal (动物活性成分化学) . T ianjin (天
津) :T ianjin T echnology Press (天津科技出版社) , 1995:1685～1693
2 Aiello A , Fattoruss o E , Menna M. Steroids , 1999, 64:687～7143 Djerassi C. Pure Appl . Chem . , 1978, 50:171～184
Q uantitative Analysis of Steroids Purity Using
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H Nuclear Magnetic R esonance Spectrum
Xue S ong , Hu Jiehan , Zhang Wei , Y u X ingju , Y uan Quan
(Dalian Institute o f Chemical Physics , Chinese Academy o f Sciences , Dalian 116023)
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Abstract H nuclear magnetic res onance spectrum was applied to determine the purity of steroids mixture which are similar in their structures and properties. A steroid mixture , is olated from marine sponge , Hymeniacidon perleve
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ββwas identified as 52cholestan 232Ol and cholesterol. Cholesterol content ranges from 4. 68%～27%in 7sam ples. The method provides a new way to analyse the steroid mixture which can not be differentiated by gas chromatography Πmass spectrometry (G C ΠMS ) or liquid chromatography Πmass spectrometry (LC ΠMS ) .
K eyw ords H nuclear magnetic res onance , chromatography , quantitation , steroid , sponge , Hymeniacidon perleve
(Received 17October 2002; accepted 4April 2003)
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