米氏常数的测定
底物浓度对酶促反应速度的影响
——米氏常数的测定
一.目的要求
1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。 1.2掌握测定米氏常数K m 的原理和方法。
二.实验原理
酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示:
V [s ]
v =
式中:
v ——反应初速度(微摩尔浓度变化/min);
V ——最大反应速度(微摩尔浓度变化/min); [s]——底物浓度(mol/L); K m ——米氏常数(mol/L)。
这个方程表明当已知K m 及V 时,酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。K m 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度,是酶的特征常数之一。不同的酶,K m 值不同,同一种酶与不同底物反应K m 值也不同,K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小:K m 值越大,表明亲和力小;K m 值小,表明亲和力大。则测K m 值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的K m 值在0.01~100mmol/L。
Linewaeaver-Burk 作图法(双倒数作图法)是用实验方法测K m 值的最常用的简便方法: 1K m 11
=. +
v V [s ]V
11K
实验时可选择不同的[s],测定对应的v ,以 v [s ]m
V 的直线,其截距
11则为,由此可求出K m 的值(截距的负倒数)。 [s ]K m
K m +[s ]
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例,采用Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸(L-精氨酸和L-赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成,可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应,求得初速度。
三.试剂和器材
3.1 试剂
A.10~30g/L的酪蛋白溶液(pH8.5):
分别取10、20、25、30g 酪蛋白溶于约900mL 水中,加20mL 1mol/L NaOH连续振荡,微热直至溶解,以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH 调pH 至8.5,定容1L ,即生成四种不同[s]的酪蛋白标准溶液。 B. 中性甲醛溶液:
100mL 分析甲醛加20 mL 0.25%酚酞乙醇溶液,以0.1mol/L NaOH滴至微红,密闭于玻璃瓶中。
C.0.25%酚酞乙醇溶液: 2.5g 酚酞以50%乙醇溶解,并定容至1L 。 D. 标准0.1mol/L NaOH溶液: 事先用邻苯二甲酸氢钾标定过。
3.2 材料
胰酶溶液:称取3g 胰酶(胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物)溶于25ml 蒸馏水中,放入冰箱保存。 3.3 器材
恒温水浴;50ml 三角烧瓶(×16),150ml 三角烧瓶(×4);吸管5ml (×1),10ml (×5);量筒100ml (×4);25ml 碱式滴定管及滴定台,蝴蝶夹;恒温水浴;滴管。
四.操作方法
1. 取50mL 三角瓶4个,加入5mL 甲醛与1滴酚酞,以0.1mol/L标准NaOH 滴 定至微红色,4个瓶颜色应当一致,编号。
2. 量取30g/L酪蛋白50mL ,加入一150mL 三角瓶,37℃保温10min ,然后吸取 5mL 酶液加到酪蛋白液中。(同时计时!)充分混合后立即取出10mL 反应液(定为0号样品)加入一含甲醛的小三角瓶中(1号)加10滴酚酞。以0.1mol/L NaOH 毫升数,记下耗去的0.1mol/L标准NaOH 的毫升数。
3. 在2min ,4min ,6min 时,分别取出10mL 反应液,加入2号,3号,4号小三角瓶,同上操作,记下耗去NaOH 的毫升数。
以滴定度(即NaOH 的毫升数)对时间作图,得一直线,其斜率即初速度为V 40(相对于40g/L的酪蛋白浓度)。
然后分别量取25g/L,20g/L,10g/L的酪蛋白溶液,重复上述操作,分别测出V 25 、V 20 、V 10。
利用上述结果,以1/v对1/[s]作图,即求出V 与Km 值。
五.实验数据处理
5.1. 实验原始数据记录:如表1中所示。
表1 实验数据记录
实验号(酶解时间/min)
酪蛋白浓度 10g/L 20g/L 25g/L 30g/L
1(0)
2(2)
3(4)
4(6)
NaOH 消耗的体积/ml
0.88 1.19 1.51 1.51
1.32 1.67 1.87 1.98
1.52
1.74 2.35 2.80 2.99
2.07 2.29 2.53
5.2相对各浓度酪蛋白的各初速度值
以滴定度(即NaOH 的毫升数)对时间作图,得一直线,其斜率即初速度值。
(1)相对于10g/L酪蛋白的初速度V 10
根据数据作图得图1-1。由图1-1中得直线方程y=0.139x+0.948,其斜率为0.139,即为V 10=0.139g/L ·min 。
(2)相对于20g/L酪蛋白的初速度V 20
根据数据作图得图2。由图2中得直线方程y=0.194x+1.238,其斜率为0.194,即为V 20=0.194g/L·min 。
(3)相对于25g/L酪蛋白的初速度V 25
根据数据作图得图1-3。由图1-3中得直线方程y=0.215x+1.474,其斜率为0.215,即为V 25=0.215 g/L ·min 。
(4)相对于30g/L酪蛋白的初速度V 30
根据数据作图得图1-4。由图1-4中得直线方程y=0.250+1.504,其斜率为0.250,即为V 30= 0.250g/L ·min 。 5.3求解V 与Km 值
表2 求得的v 与 [s]值
酪蛋白浓度[s]/(g/L)
10 20 25 30
1/[s]
初速度v /(g / L·min)
1/v
0.100
0.050 0.040 0.033 0.139 0.194 0.215 0.250 7.194 5.155 4.651 4.000
以1/v对1/[s]作图,得一直线(见图2),其斜率即Km/V,截距即1/V,即求出V 与Km 值。
由图2可知,斜率为45.14,截距为2.7334,即Km /V= 45.14 ,1/V=2.7334 所以,Km=45.14/2.7334=16.51g/L 六.实验结果与讨论
实验表明,反应速度只在最初一段时间内保持恒定,随着反应时间的延长,酶促反应速度逐渐下降。原因有多种,如底物浓度降低,产物浓度增加而对酶产生抑制并加速逆反应的进行,酶在一定PH 及温度下部分失活等。因此,研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
在本实验中,图1-1和1-2线性不是很理想,可能的原因有: (1)酶促反应的时间没有得到严格的控制
(2)实验所用的酶是粗酶液,是胰酶溶液是胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物,并不是纯酶。我们知道酶的催化具有高度的专一性,一种酶只能作用于特定的底物,所以本实验中所用的酶不能准确反应酶作用于底物的反应速度。
七.思考题
1. 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。
(1) 在生化反应中,若酶的浓度为定值,底物的起始浓度较低时,酶促反应速度与底物浓度成正比,反应相对于底物是一级反应。
(2) 在较高的底物浓度下,酶被饱和,进一步提高底物浓度,反应速度提高,但并不是成比例增加,反应相对于底物是混合级反应。
(3) 当所有的酶与底物结合生成中间产物后,即使再增加底物浓度,中间产物浓度也不会增加,酶促反应速度也不增加,反应相对于底物是个零级反应。
在实际测定中,即使酶浓度足够高,随底物浓度的升高,酶促反应速度并没有因此增加,甚至受到抑制。其原因是:高浓度底物降低了水的有效浓度,降低了分子扩散性,从而降低了酶促反应速度。过量的底物聚集在酶分子上,生成无活性的中间产物,不能释放出酶分子,从而也会降低反应速度。
2. 在什么条件下,测定酶的Km 值可以作为鉴定酶的一种手段,为什么?
当酶作用的底物是酶的最适底物时,并且在最适的pH 最适温度以及离子强度等条件下,测定酶的Km 值可以作为鉴定酶的一种手段。因为同一种酶的不同底物作用,不同pH 、温度以及离子强度等条件下测定的Km 值是不同的。
3. 米式方程中的Km 值有何实际应用?
(1) 鉴定酶:通过测定Km ,可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。
(2) 判断酶的最适底物:一种酶如果可以作用于几个底物,就有几个Km 值。测定各种底物的Km 值,Km 最小的就是最适底物。
(3) 计算一定速度下的底物浓度:由Km 值及米氏方程可决定在所要求的反应速度下应加入的底物浓度。
(4) 了解酶的底物在体内具有的浓度水平
(5) 判断反应方向或趋势:催化可逆反应的酶,对正逆两向的Km 值通常是不同的。
(6) 推测代谢途径
(7) 判断抑制类型:测定不同抑制剂对某个酶的Km 值及Vmax 的影响,可以判断该抑制剂的抑制作用类型。