棉纤维基因克隆进展参考文献2

棉花纤维品质基因克隆研究进展综述

引言:

棉花是重要的经济作物，也是纺织工业的主导原料，在世界及我国国民经济中占重要地位，近15 年来，我国棉花产量居世界第一，是世界原棉、纺织品和服装生产大国，但是国产棉花纤维品质与国外产棉国差距明显. 农业部棉花品质监督检验测试中心在1997主产棉省 (区) 主要个棉花当家品种的纤维品质抽检的结果表明, 我国原棉内在品质多数以上(70%)处于国际中等或中上等水平[[1],

棉花纤维品质好坏是质关系到我国棉花产业进一步发展的一项重要生理指标, 目前对其基因克隆的研究正如火如荼, 诸多技术手段被运用于纤维基因的克隆，1994一2002年世界各国的专利中, 有29项与棉花纤维发育相关基因克隆及棉纤维品质分子改良的研究专利有关, 其中由中国人完成的仅2项. 1999年后，我国意识到纤维品质基因的研究克隆涉及到我国未来棉花产业以及纺织工业的安危，开始大力资助棉纤维发育的基因克隆与相关的转基因育种的研究也逐渐迎头赶，取得了一系列成果。

一．棉花纤维品质概述

棉纤维是由受精胚珠的单个表皮细胞经伸长、加厚而成的种子纤维，与一般的韧皮纤维不同，棉纤维以纤维素为主，占干重的93％-95％，其余为各种糖类脂类。棉纤维是由胚珠表皮细胞经分化发育而来是单细胞纤维, 棉纤维发育过程可分为4个时期:棉纤维发育的起始期、伸长期、次生壁增厚期和成熟期, 其中伸长期与次生壁增厚期往往同时开始，具有相互重叠的时域[2][2]。这在棉纤维形成的4个时期里, 不仅有纤维细胞纵向的伸长等形态结构改变, 而且伴随着重要生理生化机制在许多基因的调空下有一系列物质的合成分解, 其间, 几千个基因表达参与纤维发育过程, 棉花成纤维的遗传机制极其复杂[2]。棉纤维的品质好坏主要看纤维长度、强度、伸长率、马克隆值等测定值，纤维品质性状为多基因数量遗传，其遗传机制相当复杂。

二．棉花纤维品质基因克隆的意义

由于棉纤维的发育涉及到棉花产量以及质量，是重要的经济性状作，做为纺织工业原料棉花纤维品质的好坏是一个关系棉花产品生产加工质量好坏的决定因素。国产棉花纤维长度能够满足大批量的中支纱、中高支纱虽的要求，但纤维强度偏低，纺织工业尤其是优质纺织品需要的纺高支纱的优质棉仍需大量进口。因此以改善棉花纤维品质为目的基因克隆技术通过克隆出棉纤维发育过程中影响棉纤维品质好坏的关键基因，精确阐释其功能, 可以深入认识棉纤维伸长和纤维素生物合成过程中的分子机理, 进而通过转基因手段或者开发出相应

的功能标记有利于分子标记辅助育种，从而培育出优质纤维品质的新品种[3]。

三．棉纤维基因克隆技术

棉花的纤维品质性状属于典型的数量性状，控制它的基因数目众多几乎在棉花13对染色体上都有分布，当前，科学家对整个棉纤维发育过程的细胞微细结构、生理生化变化研究得比较清楚, 而相关基因的分离鉴定以及克隆研究则起步较晚[3]。直至1992年John 和Crow 才首次报道纤维特异表达基因[4]标志着对纤维品质的基因研究才拉开序幕。进入21世纪以来，伴随着生物工程技术的进步，作物基因的克隆技术已经十分完善，目前用于棉花纤维品质基因克隆方面的主要技术有;(1)功能克隆技术(2)DNA芯片技术，(3)mRNA差异显示技术

（4）抑制差减杂交(SSH)等，国内外众多学者利用这些技术鉴别和克隆了许多与棉花纤维品质形成有关的基因。

这些技术中最主要使用的技术是功能克隆技术，该技术主要是根据棉纤维发育过程中表现的一些基本生化特性这一基本信息, 在鉴定已知基因功能的基础上进行克隆。在实际操作中，首先纯化相应的与纤维发育有关编码蛋白，后将纯化的蛋白质进行测序, 根据氨基酸序列结果合成的寡核昔酸探针，再用探针与cDNA 文库或基因组文库杂交选出编码基因[4]。

为了克隆特异基因往往需要建cDNA 文库，然而构建cDNA 文库需要花费大量的人力物力, 使功能克隆技术往往受到资金，人力诸多限制，现在，一些新的方法逐渐被被用来克隆目的基因，如同源序列克隆基因等技术，它利用其它植物的同源序列设计兼并引物, 采用RACE 技术扩增得到基因的序列全长[5]。

目前国际上，一些发达国家的研究小组利用大规模测序技术获得了棉花大量的表达序列标签EST 。目前, 在GneBank 和NCBI 的 EST 数据库中公布了陆地棉约23万条棉花的EST

[6][6]标志着棉花基因表达谱已经基本建立, 棉纤维发育生物信息数据库为未来棉纤维基因克隆提供了更方便的途径。

四：棉纤维不同发育阶段的基因克隆

(1. 棉纤维起始阶段基因克隆

棉纤维的发育调控极其复杂有序[7]研究发现，棉纤维发育的起始与转录因子有重要的关系，目前克隆到的大部分起始阶段的基因大部分都是控制转录因子合成基因。，其中转录因子在棉纤维发育过程中的作用不可低估。Samuel Yang[[8]]等对棉纤维发育早期棉花胚珠EST 分析结果表明，约10%的基因编码转录因子，这些转录因子的在此时的大量表达与纤维的形成具有莫大的关系。

1． MYB 类转录因子

Wang 等在研究棉花纤维基因控制时发现，棉花CaMYB2蛋白在表皮毛的生长中起调控作用。进一步研究证实，MYB 基因家族的多个成员在棉纤维发育的初始阶段与伸展阶段在胚珠中表达。Loguerci 等[9]通过PCR 法，从棉花胚珠cDNA 文库中分离出6个棉花R2R3 -MYB 家族基因 (GhMYBl一GhMYB6 ) 。这些Ch-MY 基因分别在开花期9d(前分化期) 、开花期1d(纤维扩展启动期) 和开花后15d(纤维极性伸长启动期) ，与纤维发育的几个关键时期出现表达高峰，

Silflow[10]等(1987)克隆到一个在拟南芥叶表皮毛早期分化发挥关键调控作用的6艺ABROUS 了(GLI)基因,Arioli[11]等(1998)也从金鱼草中克隆到一个调控圆锥细胞或多细胞表皮毛分化的刀双笙搜基因, 这两个基因的编码蛋白均属于一类植物MYB 族的转录因子。

2.SPB 转录因子

研究表明，SPB SPL8家族主要与植物表皮毛的生长发育密切相关，GhSPB8基因有组织特异性，在胚珠中表达，但在其他营养器官根、茎、叶中不表达，该基因可能参与了纤维起始阶段的发育调控。

3．MADS 类转录因子

植物、动物和真菌中都己发现多种MADS 基因，MADS 转录因子的结构域是由56 - 58个氨基酸组成，的高度保守的区域。MADS 家族在调控整个植物的生长发育过程中起着重要作用，基因是胚珠和种子特异性基因。胚珠是子房内着生的卵形小体，是种子的前提。棉纤维是由胚珠外的表皮细胞发育而来，研究胚珠的发育对棉纤维具有重大意义[12]。尤其是对于植物花器官的发育。研究证明，棉花MADS-boX 、蛋白基因(GhMAD-13)在控制花器官的诱导与发育中起重要作用圈，充分表明了转录因子在棉纤维细胞分化起始过程中起重要作用关。

(2) . 棉纤维的棉纤维发育伸长阶段基因克隆

John 和Kellerl[8]筛选到H6基因, 它在处于纤维伸长前期的纤维细胞中优势表达, 但它的积累却是发生在随后的次生壁增厚期. 这表明H6基因的表达是受翻译后调控, Delme:等[13]从棉花cDNA 文库中筛选出2个与哺乳动物rac 基因高度同源的克隆Racl3和Rac9, 其中Rac13在棉纤维发育过程中优势表达，且于纤维伸长向次生壁增厚的转换期表达量达到最大

蒋建雄等[14]从陆地棉纤维cDNA 文库中筛选到一个与纤维发育有关的一个陆地棉半胱氨酸蛋白酶全长cDNA 序列, 命名为GhbZIP, 该基因主要是开花3天之后在胚珠和纤维细胞中表达, 该基因可能与棉纤维伸长过程中的基因表达调控有关

张德静等[15]从棉花CDNA 文库中将编码富含脯氨酸的蛋白质基因GhPRP5基因进行了

一系列实验如构建了GhPRP5的过量表达载体，抑制转基因拟南芥植株的生长发育，抑制,GhPRP5基因表达促进棉纤维细胞伸长证明了GhPRP5基因决定棉花纤维长度的关键基因之一.

刘迪秋等[16]为了分离棉纤维特异表达基因，以陆地棉遗传标准系“TM-1’为材料，构建了两个纤维细胞的抑制差减杂交(SSH) cDNA文库。来自于10DPA 和20DPA 的纤维cDNA 分别作为两个SSH 文库的 Tester ，来自五个非纤维组织根、下胚轴、叶、花瓣、胚珠的混合cDNA 作为两个文库的共同 Driver 。反向Northern 杂交后在两个文库中共筛选到292个克隆.

索金凤, 普莉[17]等通过cDNA 阵列方法分离到一个基因与拟南芥IAA16具有很高的同源性, 并命名为GhlAA16, 该基因以单拷贝形式存在, 在棉花胚珠内种皮中特异表达, 是棉花中第一个分离到的内种皮特异表达的基因。

(3) . 棉纤维次生壁加厚相关基因克隆

Pear 等(1996)[18]对次生壁增厚高峰期的棉纤维cDNA 文库进行随机测序分析, 克隆到2个与细菌纤维素合成酶催化亚基CeM 基因具有一定同源性的基因GhCeMl 和GhCelA2, 首次在高等植物中获得了纤维素合成酶基因，Laosinchai 等[19](2000)在此基础上分离出了第3个棉花纤维素合成酶基因GhCelA3。

郭惠明等[20]以陆地棉石远321为材料, 利用ＲＡＣＥ技术克隆了陆地棉的全长ｋｏｂ基因—Ｇｈｋｏｂ。Ｋｏｂ基因是一种编码纤维素合成所需蛋白的基因, 与纤维素微纤丝的排列有关, 继而影响到细胞的伸长, 尤其是快速伸长的细胞, 该基因突变体的纤维素合成受阻, 纤维素的急剧减少, 进而会导致微纤丝的随机排列, 造成植株形态矮小。棉花纤维中纤维素含量达到95%,是研究纤维素合成基因功能的理想体系; 通过研究发现的纤维发育关键基因又可以用于棉花纤维品质的改良[34]。

夏桂先等[21]发现了一个在棉纤维发育过程中起着关键调节作用的类受体膜蛋白激酶ＧｈＲＬＫ1[24]。ＧｈＲＬＫ1是一种Ｓｅｒ/Ｔｈｒ激酶和Ｔｙｒ激酶的双受体, 在棉纤维细胞次级细胞壁合成过程中特异性的表达, 并且研究证明ＧｈＲＬＫ1涉及的细胞信号传导可能涉及激活和维持次级细胞壁的形成相关。

(4).棉纤维成熟阶段基因克隆

棉纤维成熟期是指棉铃开裂、吐絮, 裂后5?7天, 纤维逐渐失水, 由于纤维素以螺旋方式沉积产生的内应力引起表面收缩, 从而使棉纤维产生左旋或右旋卷曲的成熟过程。但迄今为止，棉纤维程序性死亡、脱水、螺旋过程的分子机制尚不明确。在这方面的研究成果极少，

也证明了这一机制的复杂性和未来需要我们进一步去探索的必要性。目前一些科学家认为这一机制主要与棉纤维的水分子调控机制有关。Rineliartetal 等[22]现已克隆的FbL2A 基因在棉纤维发育过程中优势表达, 其表达受发育调控，推测该基因编码的亲水蛋白可能对在纤维脱水成熟时的细胞结构起到保护作用(Rineliartetal.,1996)。

五：展望：

克隆与棉纤维发育相关的基因, 从分子水平改良棉纤维品质, 已成为棉花基因工程主要研究方向, 并对其功能作出精确评价是了解棉纤维细胞发育过程的一个重要条件。目前虽然在棉纤维发育过程中的基因表达与调控方面的研究取得了令人瞩目的成果, , 仍有几个关键问题需要进一步地深入研究。如：1. 克隆到基因大部分是在起始纤维伸长阶段表达, 少数在纤维细胞壁增厚期或整个发育过程均能表达, 成熟阶段克隆到的基因较少。2对它们的表达调控研究主要集中在转录水平从基因表达的整体水平研究不够。3. 未能克隆出真正调控细胞伸长发育及增强纤维强度表达的基因，科学家一直希望从棉花中克隆出纤维素合成酶基因, 但是由于纤维素合成酶在离体条件下的活性极低而未能成功。毫不夸张的说，利用分子生物学方法改良棉纤维的潜力还远没有发挥，进一步阐明其遗传机理, 并获得相关目标性状的分子标记, 仍是今后发展及加强研究的方向。

参考文献：

[1].郭旺珍, 孙敬, 张天真. 棉花纤维品质基因的克隆与分子育种[J]. 科考通报, 2003, 48(5):410-418..

[2].张辉, 汤文开. 棉纤维发育及其相关基因表达调控研究进展[J]. 植物学通报, 2007, 24(2):127-133..

[3].刘进元, 赵广荣, 李 骥. 棉花纤维品质改良的分子工程[J]. 植物学报, 2000, 42(10):991-995..

[4].]胡根海, 喻树迅. 棉花基因克隆研究进展[J]. 棉花学报, 2005, 17(4):240-244..

[5].沈法富. 短季棉衰老的激素变化及衰老相关基因的克隆[D].中国农业科学院研究生院,2003..

[6].陈蔷, 崔百明. 棉花纤维品质分子改良研究进展[J].中国生物工程杂志, 2009, 29(5):111-115.

[7].郭丽雪, 王永强. 棉花纤维发育相关转录因子的研究进展[J]. 河北农业科学, 2011, 15(6):50-52..

[8]Samuel Yang S , Cheung F, Lee J JWei N E , Sze S,Stelly D M , Thaxton P.

Ac;c;umulation of genome-specific transcripts ,transcription factors and phytohormonal regulators during early stages of fiber cell development in.

[9]. Loguerico L L, Zhang J Q, Wilkins T A. Differential regulation of six novel MYB-lomain genes defines two distinct ex-pression patterns in allotetraploid cotton(Co.s.sypium hir.sutumL)[J] . Mol Gen Genet.

[10]. 105.SilflowCD,OppenheimerDqKoPezak5D.Planttubulingenes:strUctureanddifferential exPressionduringdeveloPment.Dev.Genet,1987,8:435一60.

[11].45.Arioli工PengL,BetznerAS,etal.Molecularanalysisofcellulosebiosynthesisin

ArabidoPsis.Seienee,1998,279(5351):717一724

[12]吴东; 喻树迅; 范术丽; 宋美珍; 王力娜;; 棉花MADS-box 蛋白基因(GhMADS-13)的克隆和表达分析[J];基因组学与应用生物学; 2009 28 (2):223-228.

[13]. Delmer D P, Pear J R, Andrawis A, et al. Genes encoding small GTP-binding proteins analogous to mammalian Rac are preferentially expressed in developing cotton fibers. Mol GenGenet, 1995, 48: 4351.

[14].蒋建雄, 张天真一个陆地棉半胧氨酸蛋白酶全长cDNA 的克隆及其序列特征分析[J].作物学报, 2004,305:512一515..

[15]. 张德静. GhPRP5基因在棉纤维发育中的功能研究[D]. 武汉:华中师大, 2012..

[16]. 刘迪秋. 陆地棉纤维特异表达基因的克隆与表达研究[D]. 武汉:华中农业大学, 2007..

[17]. 索金凤, 普莉, 梁小娥,. 棉花胚珠内种皮特异基因GhIAA16的分离鉴定「J 〕. 植物学报,2004, 46,4:472一479..

[18]. P ear JR, Kawagoe Y,Schreckengost WE,et al. Higher plants contain homologs of the bacterial celA genes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,

[20]. 郭惠明. 陆地棉纤维发育相关基因Ｇｈｋｏｂ的克隆及功能分析[Ｄ].北京:中国农业科学院,2005.

[21]LiYL,SunJ,XiaGXeta1.Cloning and characterization of a gene for an LRR receptor —like protein kinase associated with cotton fiber development [C]. MolGen Genom ,2005,273: 217～224.

[22].Rinehart JA, Petersen MW, John ME. Tissue-specific and developmental regulation of cotton gene FbL2A. demonstration of promoter activity in transgenic plants [J]. Plant Physiology, 1996,