葡萄酒酿造中苹果酸_乳酸发酵的应用
综 述
葡萄酒酿造中苹果酸-乳酸发酵的应用
刘福强，赵新节*
（山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南 250353）
摘 要：苹果酸-乳酸发酵（MLF ）是葡萄酒酿造中非常重要的二次发酵过程，可有效降低葡萄酒中的苹果酸，突出果香，改善口感，是葡萄酒生物降酸的主要方法。本文介绍了苹果酸-乳酸发酵在葡萄酒酿造中的作用，以及苹果酸-乳酸发酵的诱导和抑制，对影响苹果酸-乳酸发酵的环境因素和现代发酵工程技术在苹果酸-乳酸发酵中新的应用与发展也作了阐述。
关键词：葡萄酒；MLF ；降酸葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF ）是酒精发酵后由乳酸菌引起的第二次发酵，该过程将苹果酸经脱羧作用转化为乳酸和CO 2。MLF 最重要的作用之一就是用于葡萄酒的降解。在较寒冷的葡萄栽培区，酒精发酵后的生葡萄酒中有机酸含量很高，控制良好的MLF 不仅降酸效果明显，而且增加香气的复杂性和进行风味修饰等。法国、美国、加拿大等国对MLF 进行了较为深入的理论探讨和研究，并在葡萄酒生产中已得到了较广泛的应用，而我国对其研究相对较少[1]。1 MLF的作用1.1 改变色泽
在MLF 过程中，葡萄酒总酸下降、pH 上升，从而导致葡萄酒的色调由紫红向蓝色转变。此外，酒类酒球菌利用了与SO 2结合的物质
如丙酮酸、α-酮戊二酸等，释放出SO 2，游离的SO 2会与花色苷结合而降低葡萄酒的色度[2]。在有些情况下，经过MLF 后，色度可下降30%左右，从而使葡萄酒颜色变的老熟。1.2 风味修饰
进行MLF 的酒类酒球菌可以分解酒中的柠檬酸生成乙酸、双乙酰及其衍生物（乙偶姻、2，3-丁二醇）等风味物质。其代谢活动也改变了葡萄酒中的醛类、酯类、氨基酸、维生素等微量成分的浓度和含量，增加了葡萄酒风味的复杂性，对酒的风味有修饰作用[3]。此外，MLF 可以增加单宁缩合度和增加单宁胶体层，使葡萄酒的口感更为柔和。并且在MLF 过程中，植物性香味减少，能使葡萄酒的水果风味更好的展现出来。
1.3 增加细菌学稳定性
经过MLF 的葡萄酒比没经过MLF 的葡萄酒稳定得多。苹果酸和酒石酸是葡萄酒中的两大固定酸。与酒石酸相比，苹果酸为生理代谢活跃物质，易被微生物分解利用[4]。通常的化学降酸只能去除酒石酸，而葡萄酒经过MLF 可使苹果酸分解，MLF 完成后，经过抑菌、除菌处理，使葡萄酒细菌学稳定性增加，从而避免在储存过程中和装瓶后可能发生的二次发酵[5]。2 影响MLF 的因素2.1 主要因素2.1.1 酒精
酒精可通过影响苹果酸分解酶活力来影响MLF 。Graca 等[6]认为酒精会影响细菌细胞质膜的通透性而造成对细胞生长和发酵必须的辅酶因子和离子的流失从而影响细菌的活力。当酒精度超过了10%（v/v）时，酒精就会变成
收稿日期：2009-03-12
作者简介：刘福强（1984-），男，山东轻工业学院在读硕士研究生，研究方向：葡萄酒研究与开发。E-mail ：[email protected]。
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通讯作者：赵新节。 E-mail：[email protected]
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阻碍乳酸菌生长的重要因子。还有研究表明，12.5%（v/v）的酒精不仅抑制乳酸菌的生长，还造成大量的乳酸菌死亡。但乳酸菌对酒精的耐受力有较大的差异，生产上可以通过筛选酒精抗性强的菌株或者添加8%酒精进行驯化以提高酒精抗性[7]。2.1.2 SO2
SO 2能强烈抑制乳酸菌的ATP 酶活性。10～25mg/L的SO 2对乳酸菌群影响不大，但浓度超过50mg/L时，能明显推迟MLF 或者使其不能进行。此外，低pH 与SO 2抑制作用有协同效应。2.1.3 pH
p H 能够影响乳酸菌的成活率、生长速率以及在葡萄酒中的生长种类，从而影响MLF 前迟滞期的长度以及MLF 速度。pH 越低对菌体的生存与生长的影响就越大。当pH ≤3.0时，几乎所有的乳酸菌都能受到抑制，并且通常需要进行MLF 降酸的葡萄酒的pH 在3.1～3.4之间，因此接种或者自然诱发MLF 都要求葡萄酒的起始pH 值在3.1以上。2.1.4 温度
Beelman 等[8]认为，乳酸菌最适生长温度为22℃，12℃以下生长缓慢，32℃以上时，乳酸菌前期生长速度很快，然后迅速停止，最高生长温度为35℃，致死温度为60℃。在实际应用中，MLF 的温度多在18～20℃。2.2 其他因素
除了上述4个因素之外，还有其他影响MLF 的报道。有研究表
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明某一葡萄品种（如美乐）的单宁会对乳酸菌产生消极影响，从而影响MLF [9]；乳酸菌对过量的氧气非常敏感，因此在酒精发酵后应该避免过多氧气的存在；在一些条件下，某些酵母菌株可能产生高浓度的SO 2，从而会对细菌的活性产生消极的影响；CO 2对乳酸菌的生长有促进作用，所以发酵后，晚除酒渣或不除酒渣有利于保持CO 2含量，容易发生MLF ；添加延胡索酸、山梨酸、多酚物质、对羟基苯甲酸庚酯、焦碳酸乙酯、氯霉素、短乳杆菌素、溶菌酶、一溴代醋酸等抑菌剂能抑制苹果酸-乳酸细菌的生长；参与发酵的主要酵母对苹果酸-乳酸细菌的生长和MLF 有影响，葡萄汁酵母（酿酒酵母）、贝酵母的某些菌株对苹果酸-乳酸细菌的生长有拮抗作用；一些酿造工艺如澄清操作、带皮浸渍发酵、葡萄酒的热处理和红葡萄酒的热浸渍都能影响MLF 。
最近，有研究表明，在低温、较低pH 、较高酚类物质含量等不利条件下或正常条件下向葡萄酒中添加甘露糖蛋白，都可以促进MLF 的启动，并可加快MLF 的进程，对不同的乳酸菌种或制剂，甘露糖蛋白对葡萄酒MLF 进程的促进效果不尽相同[10]。但要将甘露糖蛋白用于红葡萄酒的实际酿造，还需要对添加量、添加时机、作用机理等作进一步深入研究。3 MLF的诱导3.1 自然诱导
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诱导自然MLF 的因素包括：（1）酒精发酵前较低的总SO 2浓度，一般≤70mg/L，酒精发酵结束后不再添加SO 2；（2）保证酒的pH 在3.2～3.3以上；（3）保持酒的温度大约16～25℃；（4）延长酒脚和 www.simei.it酒的接触时间，使酵母自溶物刺激乳酸菌的生长；（5）延长葡萄浸渍时间，产生更多的刺激乳酸菌生长的浸出物；（6）低酒精度（一般＜14%）；（7）选择用于酒精发酵的合适酵母也可促进自然MLF 。
自然进行MLF ，无法控制和选择参与发酵的乳酸菌属，从而无法获得可预测的结果，目前进行MLF 是采用人工诱导[11]。3.2 人工诱导
生产上常利用优良乳酸菌种添加到葡萄酒中，以人工诱导MLF ，从而克服自然发酵不稳定、难控制等问题。现在用于诱导的乳酸菌常是活性干乳酸菌和冷冻浓缩物，以及利用引子培养物（含乳酸菌的发酵剂），不但可以迅速达到触发MLF 的数量级，而且在MLF 过程中居于主导地位。要根据不同地域条件和原料品质选择适宜的菌种。
使用专门的菌种进行接种促发MLF 过程的重要性并没有被过分夸大。葡萄酒中生物胺的存在已经是一个不争的事实。并且，如果不能遵照详细的标准或者是最低的数量规定限制葡萄酒中的生物胺，其葡萄酒产品就得不到消费者的认可。许多国家包括瑞
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士已经建立一个最低的可接受组胺水平（10mg/L），专家也持有相同观点，而且几个欧洲国家也很快会遵循这个规定。过多的组胺水平是一种特别现象，会导致一定的敏感性[12]，这在很大程度上要归咎于葡萄酒自发的过程。因此要极力推荐使用专业的菌种，以确保生物胺维持一个较低的水平并且在一个可接受的标准范围内。4 MLF的抑制
一般来说，如果希望获得醇美、丰满、适于储藏的红葡萄酒，应该完成MLF 。而欲获得口味清爽、果香味浓、尽早上市的白葡萄酒，则应该防止这一发酵的进行，为此，可采取以下抑制措施：保持葡萄酒的pH ＜3.2；使酒精度达14％以上；降低贮酒温度至15℃左右；把总SO 2浓度调至50mg/L以上，尽早倒酒和澄清；减少葡萄皮的浸渍时间；巴斯德灭菌和滤菌板过滤；添加化学抑制剂；添加细菌素，如乳酸链球菌素、植物乳杆菌素和片球菌素等；添加溶菌酶[13]。
5 现代生物技术在MLF 中的应用5.1 固定化技术的应用
固定化技术是20世纪60年代在相应学科发展的基础上产生的一种新的生物技术。所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的微生物细胞或酶，定位于限定的空间区域并使其保持活性，使之成为连续流动的生物反应器，并可反复使用的一种基本技术。包括固定化酶技术和固定
化细胞技术。
微生物的固定化法主要有包埋法、吸附法、交联法和微胶囊化4种。其中包埋法是细胞固定化最常用的方法，可分为微胶囊法和凝胶包埋法。前者是利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；后者是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，经相应的造粒处理后，形成胶粒[14]。包埋法固定化乳酸菌是固定化细胞在葡萄酒MLF 中应用最为常见的方法，它使用的载体主要有聚丙烯酰胺凝胶、k-角叉菜聚糖、海藻酸钙、橡木片以及DEAE 纤维素[15]。
与固定化技术相比， 固定化酶技术需要酶的分离，并且需要辅酶再生，因此该技术在生产上的应用受到很多限制。5.2 膜生物反应器的应用
膜生物反应器技术是对固定化技术的发展，是通过凝胶膜、人工聚合膜或其他膜载体把酶-酶、酶-辅酶、酶-细胞或细胞器-酶等反应组元固定起来（也可以是游离态）进行生化反应。目前，该技术已被用来进行MLF 的研究。Vaillan 等[16]从酒明串珠菌8406中提取纯化了苹果酸-乳酸酶（MLE ），并把游离的MLE 和辅酶因子通过特制的膜及有机玻璃反应板制成生物反应器进行MLF ，结果表明，苹果酸的分解率可达70%以上。5.3 分子生物学的应用
近年来，分子遗传学手段已经应用到了葡萄酒微生物的
育种领域。Williams 等[17]曾进行过不同乳酸菌mle 基因在酿酒酵母中的功能表达。Labarre 等[18]克隆了O.oeni 的mleA 基因，在大肠杆菌中得到表达，其蛋白的分子量为60kD 。Ansanay 等[19]使多拷贝的mleS 基因在乙醇脱氢酶（ADH1）启动子控制下，在S.cerevisiae 中得到较高水平表达，其MLE 活性是L.lactis 的3倍，他们的研究使得mle 在酵母菌中的表达较前有较大幅度的提高，但含有mle 基因的酵母转化子降解外源L-苹果酸的效率仍局限在20%以下。酿酒酵母体内由于缺乏L-苹果酸的转运蛋白而引起苹果酸盐的转运效率受到限制，是酵母转化子降解外源L-苹果酸效率不高的主要原因。Bony 等[20]将L.lactis 的mle 基因和S.pombe 的mael 基因在酿酒酵母中共表达，使L-苹果酸的降解能力大幅度提高。Volschenk 等[21]将苹果酸通透酶（mael ）和mleS 基因同时克隆到酿酒酵母中，这样就解决了底物苹果酸转移到细胞内的问题。
构建可进行MLF 的葡萄酒酵母工程菌，可免去依赖乳酸菌的MLF 过程，使两步发酵由酵母菌单独完成，缩短葡萄酒的酿造周期，避免细菌在MLF 过程中产生不必要的代谢副产物，并可减少细菌引发葡萄酒微生物破败的危害。这不仅可深化对葡萄酒微生物降酸机制的了解，而且可以丰富和发展葡萄酒酿造的工业微生物学理论，简化葡萄酒、果酒的酿造工艺，经济、有效地控制生
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物降酸过程。因此，对MLF 相关酶及基因的深入研究，具有重要的理论意义和实际应用价值。但同样也面临着许多的问题，如苹果酸-乳酸酶基因和苹果酸通透酶基因在工业微生物酵母菌中的表达及其安全性，以及菌株的遗传稳定性等问题还有待解决。
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