易错PCR技术在淀粉酶定向进化中的应用

易错PCR 技术应用于酶体外进化的研究进展

沈思军1*，马春萍2，哈杰提2，马全磊1

(1. 石河子大学动物科技学院，新疆，石河子，832003；2. 新疆西部牧业股份有限公司，新疆，石

河子，832000)

摘 要：易错PCR 技术是通过调整PCR 反应条件，产生随机错配而引入多个突变。由于该技术操作简单易行，广泛应用于酶工程改造研究中。本文介绍了易错PCR 技术的影响因素及近几年在酶工程改造中的应用进展。

关键词：易错PCR 技术；影响因素；酶工程改造

在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。常用的方法有易错PCR （error-prone PCR）、DNA 重排（DNA shuffling）、交错延伸法（staggered extension process, StEP ）、随机引物体外重组（random-priming in vitro recombination, RPR）、易错滚环扩增法（error-prone rolling circle amplification, EP-RCA）、序列饱和诱变（sequence saturation mutagenesis, SeSaM）、随机插入/删除的链交换突变（random insertion/deletion strand exchange mutagenesis, RAISE）等[1]。基本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变的酶，在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。易错PCR 是通过改变PCR 条件，提高扩增产物的三大错配率，从而获得与原来不同的DNA 序列或基因[2]，其操作简便易行，成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。本文就易错PCR 过程中影响突变率的因素和易错PCR 技术在酶分子进化中的应用这两个方面，综述国内近几年的研究进展。

1. 影响易错PCR 突变率的因素

易错PCR 技术是结合随机突变与定向筛选，利用Taq DNA 多聚酶不具有3`→5`校对功能的特点，在PCR 反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变，在特定培养基或培养条件下定向选择所需酶的方法。从而获得天然生物催化剂所不具备的某些优良特性或产生新的催化能力[2]。为提高易错PCR 引入突变的效率，常采用改变Mg 2+、Mn 2+离子浓度、调整4种的dNTPs 比例、多轮扩增等方法。

1.1离子浓度

在PCR 反应过程中，离子浓度对PCR 扩增效率影响很大。Mg 2+浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，稳定非互补配对的碱基对，增加产量；浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR 扩增失败而不出扩增条带。Mn 2+是很多DNA 聚合酶的诱变因子，加入Mn 2+可以降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率。调整Mg 2+和Mn 2+离子浓度，可以获得不同突变频率的多样性文库[3]。标准易错PCR 中Mg 2+浓度为7mmol/L，而Mn 2+浓度根据不同的模板和扩增片段长度的要求，浓度范围在0.1-0.5mmol/L之间。刘治江等[4]利用易错PCR 方法进行酶体外进化研究，在优化易错PCR 条件时设定了不同的Mg 2+和

Mn 2+离子浓度，通过扩增片段电泳检测结果确定了最佳扩增效率的Mg 2+和Mn 2+离子浓度分别为7mmol/L和0.5mmol/L。由于Mn 2+浓度受扩增片段的大小和扩增片段碱基组成等因素的影响，所以没有固定推荐的Mn 2+浓度，建立不同Mn 2+浓度梯度的PCR 反应是优化易错PCR 体系中最常采用的方法[5-9]。

1.2四种dNTPs 比例

易错PCR 体系中，4种dNTPs 比例不是1:1:1:1 ，改变4种dNTPs 的平衡，主要的目的是提高碱基错配的倾向性，降低扩增过程中聚合酶的保真性，获得更多的突变。易错P F的变化带有强烈的倾向性，碱基A 、T 突变为G 和C 的变异率高。有研究表明增加dTTP 和dCTP 浓度的致突变效果优于增加dATP 和dGTP 的效果[10,11]，因此在标准的易错PCR 体系中4种dNTPs 比例dATP\dGTP:dTTP\dCTP=1:5。为了简化易错PCR 优化过程，高义平等[12]检测了在不添加Mn 2+、不调整其它任何PCR 成分，只降低1种dNTP 浓度的条件下体外诱变，结果显示随着dATP 浓度的降低，序列变异率和碱基突变率均成升高趋势，且主要引起AT →GC 的变异。

1.3 多轮PCR

易错PCR 是一种简便快速的在DNA 序列中随机引入突变的方法，是最常的无性突变技术。该技术的关键是控制诱导片段的突变率[13]。为了有效地积累有益突变，常采用二轮PCR 的方法，以第一轮易错PCR 产物为模板，不改变PCR 体系的扩增条件进行第二轮PCR [14-16]。

2. 易错PCR 在酶体外定向进化中的应用

随着分子生物技术的发展，利用基于PCR 的方法进行酶分子改造已经取得了大量突破性成果。通过定向进化对酶进行改造后显著提高了酶的特性，获得了特定功能的工业酶。利用该方法产生的突变型β-葡聚糖酶的最适pH 由7.7变化至5.5，且保持了原有的耐热性和比酶活[17]。SPT3定向进化的菌株M25在10%的乙醇中生长良好，且提高了利用125g/L的葡萄糖进行乙醇发酵时的乙醇产量[9]。黄瑛等利用易错PCR 方法得到的突变型脂肪酶其比活力比野生型脂肪酶提高了1.31倍[18]。β-甘露聚糖酶是一种半纤维素酶类，可水解半乳甘露聚糖等，可广泛用于造纸、印染等行业，吴秀秀等从易错PCR 方法建立的β-甘露聚糖酶突变文库中筛选耐酸、耐高温的菌株，并结合DNA 改组技术获得了特定条件下高酶活的菌株[19]。越来越多的研究利用易错PCR 进行酶体外进化，这表明该技术是改造酶分子切实有效的方法，在酶的体外高效定向进化研究中有较好的应用前景。

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