中国细胞生物学学报

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2010, 32(6): 829-839http://www.cjcb.org

特约综述

我们的研究主要是以酵母为模式生物, 利用分子生物学、细胞生物学方法寻找作用于自噬体形成过程的新基因, 进一步揭示自噬体形成的分子机理, 理清上游信号转导网络对细胞自噬的调节作用。

http://medical.nankai.edu.cn/chinese/department/molecular/xiezhiping.asp

酵母中细胞自噬的研究进展

王海燕1　倪 涛2　谢志平1*

(1南开大学医学院, 天津 300071; 2南开大学生命科学学院, 天津 300071)

摘要　　细胞自噬是真核生物中高度保守的一类亚细胞降解途径。它通过降解细胞内组分维

持细胞内生理平衡并帮助细胞度过逆境。细胞自噬在生物体生长发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、预防神经退行性病变等方面有非常重要的作用。酵母是目前细胞自噬研究最充分的模式生物, 其中分子机制及其他方面的研究成果对整个真核生物细胞自噬的研究有很关键的作用。本综述旨在对近年来酵母中关于细胞自噬的研究进展和常用检测手段作一概括总结。

关键词　　细胞自噬; 分子机制; 酵母; 检测手段

1 前言

细胞自噬(Autophagy)是对维持真核生物健康有关键作用的一类亚细胞降解途径[1,2]。细胞自噬一词泛指溶酶体(Lysosome)(酵母中为液泡, Vacuole)介导的细胞质降解过程。与蛋白酶体(Proteasome)相比,溶酶体具有更强大的降解能力, 因此细胞自噬可以大批量的降解从可溶蛋白到完整细胞器在内的胞内物质。细胞自噬在生物体生长发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、神经性病变抑制等方面有非常重要的作用[3~5]。

根据包裹物质及运送方式的不同, 细胞自噬可以分为宏自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microauto-phagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy)。宏自噬通过形成具有双层膜结构的自噬体(Autophagosome)包裹胞内物质, 最终自噬体与溶酶体融合; 微自噬通过溶酶体或液泡表面的形变直接吞没特定的细胞器; 分子伴侣介导的自噬通过分子伴侣将胞浆蛋白解折叠导入溶酶体内腔。

细胞自噬现象最初由Christian de Duve等[6]在二

十世纪六十年代初发现。二十世纪九十年代初, 以Daniel J.Klionsky、Yoshinori Ohsumi为代表的一批细胞生物学家以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为模式生物展开了相关基因的筛选和细胞生物学的研究。到目前为止酵母中已经有34种细胞自噬相关基因(ATG, AuTophagy-relaetd Genes)被发现(功能及同源物情况见表1)[7]。经过二十多年的积累, 酵母已成为细胞自噬分子机制研究最为充分的模式生物。

本文介绍的重点是在酿酒酵母中发生的宏自噬。这一过程在自噬体组装位点(PAS, Pre-autopha-gosomal structure/Phagophore assembly site)发生, 自噬体前体膜囊(Phagophore/Isolation membrane)在相关蛋白的作用下扩展、生长成双层膜结构的自噬体,细胞质物质同时被包裹进自噬体内腔; 随后自噬体的外膜与液泡融合, 其内膜与内含物被水解酶降解为氨基酸等小分子物质, 为细胞重新利用, 帮助细胞度过逆境[1](图1)。细胞自噬既可以是非选择性的, 也可

*通讯作者。Tel: 022-23499550, E-mail: [email protected]

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Table 1　List of yeast Atg proteins

Name#Atg1Atg2Atg3Atg4Atg5Atg6/Vps30Atg7Atg8Atg9Atg10Atg11Atg12Atg13`Atg14Atg15Atg16Atg17Atg18Atg19Atg20Atg21Atg22Atg23Atg24/Snx4Atg25Atg26Atg27Atg28Atg29Atg30Atg31/Cis1Atg32Atg33Atg34

#

·特约综述·

Function

Serine/threonine protein kinase, regulates magnitude of autophagy.

Interacts with Atg18, mediates the retrieval of Atg9 from the PAS back to peripheral sites.E2-like conjugating enzyme, functions in the conjugation of Atg8.

Cysteine protease, removes the C-terminal arginine residue from newly synthesized Atg8 or PEfrom Atg8-PE conjugate.

Conjugation target of Atg12, part of the Atg12-Atg5-Atg16 complex.

Common component of class III PI3K complex I and II, functions in autophagy and the VPSpathway.

E1-like activating enzyme, functions in the conjugation of Atg8 and Atg12.Ubiquitin-like protein, conjugated to PE, controls the expansion of the phagophore.Transmembrane protein, shuttles between the PAS and other peripheral sites.E2-like conjugating enzyme, functions in the conjugation of Atg12.

Scaffold protein, required for selective autophagy, participates in the assembly of PAS proteins.Ubiquitin-like protein, conjugated to Atg5, part of the Atg12-Atg5-Atg16 complex.

Subunit of Atg1 complex, phosphorylation status controls the activity of Atg1 and the magnitudeof autophagy.

Autophagy-specific component of class III PI3K complex I, targets the complex to the PAS.Vacuolar lipase, functions in the breakdown of autophagic bodies.

Component of the Atg12-Atg5-Atg16 complex, mediates the oligomerization of the complex.Subunit of Atg1 complex, regulates the magnitude of autophagy, participates in the assembly ofPAS proteins.

WIPI protein, binds PI3P, interacts with Atg2 to mediate the retrieval of Atg9 from the PASback to peripheral sites.

Cargo receptor in the Cvt pathway.

Sorting nexin, binds PI3P, functions in the Cvt pathway.WIPI protein, binds PI3P.

Amino acid permease on the vacuolar membrane.Peripheral membrane protein, transits with Atg9.Sorting nexin, binds PI3P, functions in the Cvt pathway.Functions during macrophexophagy in Hansenula polymorpha.Functions during pexophagy in Pichia pastoris.Integral membrane protein, transits with Atg9.Functions during pexophagy in Pichia pastoris.

Part of the Atg17-Atg29-Atg31 complex, functions in non-selective autophagy.Receptor of peroxisomes in Pichia pastoris.

Part of the Atg17-Atg29-Atg31 complex, functions in non-selective autophagy.Receptor of mitochondria, mitochondrial outer-membrane protein.Functions in mitophagy under certain conditions.Paralogue of Atg19, receptor of Ams1.

Homologues inhigher eukaryotesYesULK1/2YesYesYesYesYesBeclin1YesYes

LC3, GABARAPYesYesYesYesYesYes

YesWIPI+

YesWIPI+

Proteins labeled with bold font are collectively referred to as the “core autophagy machinery” proteins, reflecting the fact that these

proteins are essential for autophagosomes formation and are conserved during evolution. In most cases, homologues of yeast autophagygenes found in other species are named after their yeast counterparts. Only those named differently are listed in the homologue column.

+

In general, there are multiple WIPI family members in a given species; not all WIPI proteins function in autophagy.

以是选择性的。酵母中的选择性细胞自噬主要有Cvt(Cytoplasm to vacuole targeting)途径、线粒体自噬(Mitophagy)、过氧化物酶体自噬(Pexophagy)等途径。

2 酵母中细胞自噬的分子机制

细胞自噬的整个过程从概念上基本可以分为以下几个方面: (1)细胞自噬的调控; (2)自噬体在PAS的

王海燕等: 酵母中细胞自噬的研究进展831

Fig. 1　The process of macroautophagy in yeast

a, b: obsolete or damaged organelles and proteins are sequestered into the concave side of an expanding membrane sac, the phagophore/isolationmembrane; c: the phagophore matures into a double-membrane autophagosome; d: the outer membrane of an autophagosome fuses with thevacuole limiting membrane; e, f: the inner-membrane-bound vesicle (termed the autophagic body) enters the lumen of the vacuole; eventually,the inner membrane and the cytosolic materials enclosed are degraded by vacuolar hydrolases.

Fig. 2　The composition of PI3K complexes

A: PI3K complex I contains Vps34, Vps15, Vps30/Atg6, and Atg14. Atg14 is responsible for targeting the complex to the PAS; it mediatesthe interaction between Vps30 and Vps34-Vps15; B: PI3K complex II contains Vps34, Vps15, Vps30/Atg6, and Vps38. Vps38 is responsiblefor targeting the complex to the endosome, where it participates in the VPS (Vacuolar protein sorting) pathway.

形成; (3)自噬体与液泡融合及内含物的降解与循环利用。这里需要指出的是, 尽管其在概念上处于上游,细胞自噬的调控并非仅限于自噬体形成的某一特定阶段, 而是贯穿于细胞自噬的整个过程。

在此, 我们首先介绍TOR通路, PI3K通路将在下面自噬体形成分子机制部分介绍。TOR是一个在进化上与PI3K有亲缘关系的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 对细胞自噬起到负调控作用。在正常生长条件下, TOR处于激活状态, 细胞自噬受到抑制; 当细胞处于饥饿或受到雷帕霉素(Rapamycin)刺激时, TOR被抑制, 细胞自噬被诱导增强[8]。在酵母中, TOR有两个同源基因TOR1、TOR2, 它们可以形成两种蛋白复合物: TORC1(包含Tor1或Tor2)、TORC2(仅含有Tor2)。两个复合物都参与细胞生长与细胞内

2.1 细胞自噬的调控

生理条件下, 细胞自噬受到严格的调控。现在了解得比较多的细胞自噬调控通路主要有两条: TOR(Target of rapamycin)通路和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K,Phosphoinositide 3-kinase)通路。很多其他细胞自噬调控信号直接或间接的通过这两条通路发挥作用。

832新陈代谢的调节, 而TORC1对雷帕霉素更加敏感[9];同时, TORC1可以感受细胞外的营养条件, 当细胞处于饥饿条件时TORC1被抑制, 细胞自噬水平上升[10],因此是细胞自噬的主要调节因子。

TOR可以从两方面对细胞自噬进行调节, 其中目前研究比较清楚的是通过Atg1-Atg13-Atg17复合物来调节细胞自噬的水平。Atg1是细胞自噬非常关键的一个蛋白, 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[11], 它的激活诱导细胞自噬的发生。Atg13是TORC1的底物, 在酵母中TORC1可以磷酸化Atg13上至少8个丝氨酸位点。在营养丰富的条件下, Atg13高度磷酸化, 这时它与Atg1仅有非常低的结合能力, 因此Atg1的激酶活性也很低, 自噬水平保持基底水平。当细胞用雷帕霉素处理或处于饥饿条件时, TORC1被抑制, Atg13迅速部分的脱磷酸化, 其与Atg1、Atg17的结合能力大大提高, 从而Atg1的酶活性也大大提高,细胞自噬水平迅速上升[12]。并且当细胞表达非磷酸化的Atg13突变体时, 即使在营养丰富的条件下也可以激活Atg1, 诱导细胞自噬[13]。同样, Atg17也是一个很关键的蛋白, atg17的突变体在饥饿条件下形成自噬体的能力大大受到限制; 即使形成自噬体, 其大小也不及正常情况下大小的二分之一。Atg13介导了Atg1与Atg17的相互作用; Atg17可以与Atg1-Atg13复合物相互作用, 并且这种相互作用在饥饿条件下明显升高。当Atg17与Atg13的相互作用减弱时Atg1的酶活性受到抑制, 这表明Atg17-Atg13复合物的形成也是细胞自噬的一个限制因素[12,14]。Atg1复合体除了含有Atg13、Atg17外, 还包括Atg29、Atg31、Atg11、Atg20和Atg24, 前两者主要参与非选择性细胞自噬, 后三者参与Cvt途径。

TOR调节细胞自噬的另一条通路涉及Tap42和PP2A(Protein phosphatase type 2A)磷酸酶。TORC1可以磷酸化Tap42, 磷酸化的Tap42可以激活PP2A磷酸酶。PP2A磷酸酶对细胞自噬有负调控的作用,但这方面的具体机制还不十分清楚[12,15]。

2.2 自噬体在PAS的形成

自噬体的形成是细胞自噬的关键步骤, 自噬体的大小与数量也反应了细胞自噬发生的水平, 这一步骤涉及的蛋白可分为几个系统, 包括: PAS的组装骨架(Scaffold/adaptor)、III型PI3K信号系统、Atg9循环系统和泛素样蛋白结合系统。

2.2.1 PAS的组装骨架 PAS是自噬体形成的位点; 它通常出现在靠近液泡的位置。在荧光显微镜

·特约综述·

下, 大部分Atg蛋白都可以共定位到PAS。到目前为止, PAS的定位看来是一个酵母特有的现象: 其他物种自噬体的产生位点遍布于细胞质中, 而不是局限在几个有限的位点。一般认为Atg蛋白在PAS的组装起始于几个重要的骨架蛋白, 其具体过程依赖于细胞自噬的调控诱导条件。在富营养生长条件下发生的Cvt途径中, PAS的组装信号来自该途径运送的货物-Cvt复合体, 其主要成分是Ape1多聚体和它的受体Atg19[16,17]。Atg19与Atg11结合, 而后Atg11募集其他相关蛋白, 逐渐围绕Cvt复合物形成特化的自噬体-Cvt囊泡[18]。在这一过程中, Atg11在PAS的形成中起到了组装蛋白的作用。与其相对的, Atg17在细胞处于饥饿条件、非选则性细胞自噬显著增强时起主要作用[19]。当同时敲除Atg17、Atg11时, PAS无法正常组装, 自噬体形成所需蛋白也无法正常定位于PAS上。这些骨架蛋白不仅是PAS组装的基础,同时还参与自噬体形成的各个方面, 包括对Atg1的活性的调控[12,14]、Atg9向PAS的运输等[20,21]。需要注意的是, PAS的概念是建立在荧光显微镜下多种Atg蛋白共定位的实验基础上的。受分辨率限制, 荧光显微镜观测并没有提供更精细的PAS结构信息, 特别是关于膜结构方面的信息。换言之, 我们现在并不清楚位于PAS的蛋白是否共处于同一个膜结构上,尽管我们的示意图暂且这样表示。

2.2.2 PI3K复合体及其下游作用蛋白 PI3K是一类重要的胞内信号调控分子, 它们通过对膜上的磷酸肌醇进行磷酸化修饰控制细胞生长、分化、细胞内物质的运输等过程。根据底物特异性, PI3K可以分为3类; 其中, III型PI3K是最为古老的一类, 可以将磷脂酰肌醇磷酸化为磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P,Phosphatidylinositol 3-phosphate)。酵母的基因组只含有一个基因编码PI3K, 它对应III型PI3K-Vps34(Vacuolar protein sorting 34)[22]。Vps34至少可以参与形成两种复合物: I类复合物含有Atg14, 参与细胞自噬; II类复合物含有Vps38, 参与VPS(Vacuolar pro-tein sorting)途径, 负责将蛋白由高尔基体经内含体转运到液泡[23]。二者都含有Vps34、Vps15、Vps30/Atg6。Vps15是一种蛋白激酶, 是Vps34的调节亚基[24,25]。Atg14 将Vps30/Atg6与Vps34-Vps15连接在一起, 形成复合物。起到这一作用的是Atg14 N端的I、II超螺旋结构域[26]。在细胞自噬中, Atg14将PI3K复合物定位于PAS位点, 通过其产物PI3P募集下游蛋白(图2)。

王海燕等: 酵母中细胞自噬的研究进展833

Fig. 3　The molecular machinery of autophagosomes formation#

a: the PI3K signaling system. PI3K complex I is targeted to the PAS, where it produces PI3P to recruit downstream effector proteins; b: the Atg9cycling system. Atg9 shuttles between the PAS and other peripheral sites. The anterograde trafficking of Atg9 to the PAS under nutrient richconditions depends on Atg11, Atg23, Atg27, Actin and the Arp2-Arp3 complex. Atg9 forms a complex with Atg23 and Atg27 during trafficking.Atg11 is responsible for targeting the Atg9-Atg23-Atg27 complex to the PAS. The movement of this complex is facilitated by the Arp2-Arp3complex. The anterograde trafficking of Atg9 under starvation condition depends on Atg17 (not shown). The retrograde trafficking of Atg9 requiresthe concerted action of the Atg1-Atg13 complex, Atg2-Atg18 complex and PI3K complex I; c: the Atg12 conjugation system. Atg12 isconjugated to Atg5 under the actions of Atg7 (E1) and Atg10 (E2). The resulting Atg12-Atg5 conjugate interacts with Atg16 and forms atetrameric complex. This complex transiently resides on the convex side of the phagophore, where it facilitates the correct targeting of Atg8-PE; d: the Atg8 conjugation system. Newly synthesized or PE-conjugated Atg8 is processed by Atg4 to expose the C-terminal glycine that isneeded for subsequent conjugation reaction. Atg7 (E1) and Atg3 (E2) then catalyze the conjugation of processed Atg8 to PE. Atg8-PE resideson both the convex side and the concave side of the phagophore. #At present, the details of membrane structure(s) at the PAS is lacking; it is forsimplicity that most of the membrane-associated proteins are depicted as residing on the phagophore.

在细胞自噬中, PI3K的主要下游蛋白是Atg18和Atg21。虽然Atg18、Atg21并不含有PI3P结合结构域, 但它们也可以与其相互作用[27]。细胞自噬发生时, PI3P募集Atg18, 使其定位于PAS组成Atg2-Atg18复合体并在Atg9的循环中起作用(图3)。它们中任何一个组分的缺陷都会导致Atg9聚集在PAS位点, 无法返回外周膜, 从而影响自噬体的形成。Atg18和Atg21同属WIPI蛋白家族, Atg18参与非选择性细胞自噬与选择性细胞自噬, 而Atg21主要参与选择性

细胞自噬。此外, PI3P可以募集下游含有PX结构域的蛋白Atg20与Atg24; 这两个蛋白在PI3K复合体I、II的作用下分别定位于PAS和内含体膜上, 它们

在Cvt途径中发挥一定的作用[28,29]。

需要指出的是, 由于基因序列的错误, 一个参与Atg9运输的跨膜蛋白Atg27曾被误认为是PI3K的下游蛋白。这一结论已被实验推翻[30], 但仍在近期的一些综述中出现。

2.2.3 Atg9的循环转运 自噬体膜的起源一直是

834人们致力解决的问题, 而其中的关键可能就是Atg9。Atg9是一个整合膜蛋白, 含有高度保守的6个跨膜结构域以及位于胞质中的N端与C端[31]。它在相关蛋白的协助下, 在PAS与外周膜结构(如线粒体、内质网、高尔基体)之间往复循环, 参与自噬体的形成过程, 故Atg9被认为有可能起“膜载体”的作用[20,32]。在酵母中, 大量Atg9位于线粒体膜的表面或与线粒体相连的组分上[32], 但还没有明确的证据表明线粒体膜是酵母中自噬体膜的来源之一。有趣的是, 最近在哺乳动物中也有研究表明线粒体提供了自噬体生成的膜单位[33], 尽管动物细胞里Atg9的同源蛋白并不出现在线粒体上。

Atg9从外周膜结构到PAS的运输是需要其他蛋白的协助来完成的, 在不同的条件下需要的协助蛋白也不同。在选择性细胞自噬Cvt途径中, 当Atg11、Cvt复合体或Actin细胞骨架中的组分缺失任一个时,Atg9从外周膜结构到PAS的运输都会被阻断[16,34,35]。Actin相关蛋白Arp2与Atg9相互作用, 直接调节Atg9从外周膜结构向PAS的运输; 作为Arp2-Arp3复合物的一个亚基, 它很可能促进了Atg9的运动, 并重塑Actin结构以便于Atg9的运输[36](图3)。在饥饿诱导的非选择性细胞自噬中, 这种运输需要Atg17的协助。Atg17帮助Atg9定位于PAS, 进一步完成膜的组装, 但这个过程并不需要Atg1的激酶活性[21]。Atg1在其中的作用很可能是调节Atg9在PAS位点组装与卸载之间的平衡。除此之外, Atg9的顺向转运还需要Atg23与Atg27, 它们同Atg9相似, 也是定位于PAS和细胞质中其他一些散在的膜结构上, 在转运中, 三者是作为一个复合体单位共同转移的(图3)。二者既参与Cvt途径, 又参与非选择性细胞自噬[30]。在非选择性细胞自噬中, 这两种蛋白并不是必需的: 在两者缺陷的菌株中, 自噬体仍能形成, 虽然要比正常的小[30,37]。最近又有研究发现, Atg9可以自我相互作用, 形成一个多聚复合物, 而这种多聚复合物对Atg9从外周膜结构到PAS的运输也是很重要的, 若无法形成这种多聚复合物, 自噬体的形成便会受到限制[38]。

当自噬体形成时, Atg9并不留在自噬体膜上, 而是从PAS返回细胞质中的膜结构。这一逆向运输途径依赖于Atg1-Atg13复合体、Atg2-Atg18复合体以及PI3K复合物I(图3)[39]。其中大家比较公认的模型是: 一旦Atg1-Atg13复合物与Atg9被募集到PAS,Atg1-Atg13促使Atg9与Atg2-Atg18相互作用, 这种

·特约综述·

三元复合物的形成促使Atg9从PAS返回外周膜。2.2.4 泛素样蛋白结合系统 细胞自噬中, 两个类泛素样蛋白Atg12、Atg8分别在泛素样酶的作用下与Atg5、磷脂酰乙醇胺(PE, phosphatidylethano-lamine)相结合, 促进自噬前体囊膜的不断延伸。Atg12、Atg8并没有明显的泛素同源序列, 不过它们的晶体结构显示有保守的泛素样折叠结构[40,41]。

Atg12是自噬相关蛋白中最先发现的泛素样蛋白, 其氨基酸序列C端最后一个为甘氨酸残基。与泛素化过程相类似, Atg12-Atg5的形成需要E1(泛素活化酶)、E2(泛素结合酶)样的酶, 充当这两种酶的分别是Atg7、Atg10; 这个过程中没有典型的E3(泛素连接酶)。其具体过程为: Atg7与ATP结合, 其507位的半胱氨酸被激活, 与Atg12 C端186位的甘氨酸形成硫脂键[42]; 之后激活的Atg12在E2酶Atg10的作用下, 与其133位的半胱氨酸结合, 形成硫脂键[43]; 最后Atg12与目标蛋白Atg5 149位的赖氨酸相互作用,形成一个异肽键[44]。在此基础上, Atg5与Atg16相结合, 通过Atg16介导形成Atg12-Atg5-Atg16多聚体;这个多聚体的分子量在350kDa左右, 所以这个多聚体应该是三者的四聚体[45](图3)。此外, 至今没有发现切割Atg12-Atg5之间异肽键的酶, 它们之间的结合作用是不可逆的。

Atg8

是一个独特的泛素样蛋白: 它的结合靶分子是脂类PE, 而不是一般的蛋白。首先, Atg8在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下, 切掉其末端117位的精氨酸, 从而暴露出116位的甘氨酸[46]; 之后经过修饰的Atg8与E1样酶Atg7第507位的半胱氨酸形成一个硫脂键, 这个位点也正好是Atg12-Atg5系统中的作用位点[47]; 激活的Atg8被转移给E2样酶Atg3, 与其234位的半胱氨酸残基形成硫脂键; 最后Atg8的甘氨酸残基与PE通过酰胺键连接, 从而与膜紧密相连[47](图3)。与Atg12- Atg5的结合不同的是, Atg8-PE的结合是可逆的, Atg8可以在Atg4的作用下, 被释放回细胞质[46,48]。在整个Atg8-PE的结合中, Atg4发挥了两次切割作用, 实验证明, Atg4的第二次切割作用,对细胞自噬的效率有一定影响。当将Atg8ΔR(Atg8去掉C末端的精氨酸)转入atg4Δ菌株时, 虽然Atg8-PE仍然可以正常形成, 但Atg8不能被正常释放, 细胞自噬的水平与atg4Δ菌株相比仅有少量恢复。

当非选择性细胞自噬被诱导时, Atg8的蛋白表达量迅速升高, 是自噬相关蛋白中在PAS密度最大的蛋白, 并且Atg8的量与自噬体的大小正相关[48,49]。在体

王海燕等: 酵母中细胞自噬的研究进展外重建试验中, Atg8可以介导膜的结合与半融合[50]。在自噬体形成过程中, Atg8-PE位于内外两层膜, 但当自噬体完全形成后, 外膜的Atg8会在Atg4的作用下, 释放回细胞质, 被循环利用; 而内膜的Atg8会随内膜一同进入液泡, 在水解酶的作用下降解[46,48]。

Atg12-Atg5-Atg16复合体对Atg8作用基本表现为两方面。一方面, 在自噬体形成过程中, 二者均定位于PAS位点, 但Atg8的定位依赖于Atg12-Atg5-Atg16, 而Atg12-Atg5-Atg16在atg8Δ的菌株中却能正常定位于PAS位点[19]。另一方面, Atg12-Atg5在Atg8-PE的结合过程中表现出E3的功能, Atg12-Atg5既可以与Atg3相作用, 又与含PE的脂质体相联系, 这正好符合了典型E3的作用模式(与E2的靶向底物相结合)。同时, Atg12-Atg5加速了Atg8从Atg3向PE的转移[51]。在自噬体形成过程中, Atg12-Atg5-Atg16大部分位于双层膜的外层膜[52], 这提示我们Atg12-Atg5-Atg16除了将Atg8定位于PAS外, 还可能作为膜的外被体而存在。但最近的一项研究不支持这一假设: 计算表明, 位于PAS的Atg16的分子数, 即间接的Atg12-Atg5-Atg16的分子数, 不足以紧密覆盖整个自噬体的膜[53]。就目前已有证据而言, Atg12-Atg5-Atg16最主要的功能便是对Atg8的辅助作用,而Atg8-PE是双层膜不断向外延伸的直接作用者。2.3 自噬体与液泡的融合与营养物质的循环利用

自噬体在靠近液泡的PAS形成后, 最终会与液泡融合。这个融合过程与细胞中其他囊泡与液泡的融合相类似, 该过程涉及到的蛋白有SNARE蛋白(Vam3、Vam7、Vti1、Ykt6)、小GTP酶Ypt7、HOPS复合体、Mon1-Ccz1复合体等[54~56]。融合的结果是自噬体的外膜成为液泡膜的一部分, 其内膜小泡和内含物在液泡内腔被降解。

细胞自噬的目的之一便是将细胞质中一些废弃多余的大分子物质降解重新利用。目前为止, 对这方面的研究还不是很多。自噬体内膜及内含物的降解依赖于液泡内的酸环境及水解酶, 比如Pep4、Prb1。除此之外, 酯酶Atg15也在这一步中发挥了相关作用[57]。一般来说, 降解得到的小分子会通过液泡膜上的相应通道被释放到细胞质中重新利用。现已知道, Atg22、Avt3、Avt4在部分氨基酸的释放中发挥作用[58,59]。

3 选择性细胞自噬

细胞自噬曾被长期认为是非选择性为主的, 但随

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着研究的深入, 选择性细胞自噬的生理意义愈发显著。酵母中选择性细胞自噬的研究是与非选择性细胞自噬的研究同步开展的, 现在也积累了大量的结果。酵母中的选择性细胞自噬主要有Cvt途径、线粒体自噬和过氧化物酶体自噬。

3.1 Cvt途径

Cvt途径是研究得最透彻的选择性细胞自噬。它的主要功能是将细胞质中的氨基肽酶(Ape1)、甘露糖酶(Ams1)等酶的前体定向送到液泡, 以使其激活并发挥其水解酶活性。Ape1在细胞质中以无活性的前体PrApe1形式存在[60]。PrApe1会形成一个寡聚体, 其后受体蛋白Atg19与PrApe1相结合, 而Ams1通过Atg19的另一个位点与Atg19相结合, 共同形成Cvt复合物[17,61]。Atg19与Atg11相互作用, 引导Cvt复合物定位到PAS位点; Atg11 C端的超螺旋结构负责其与Atg19的相互作用, 而其N端和中间的超螺旋结构负责将Cvt复合物定位到PAS位点上[18]。Atg19进而与Atg8-PE相互作用, 促进特化的自噬体-Cvt囊泡的形成。在Cvt囊泡形成之前, Atg11与整个复合体解离, 释放回胞质, 而Atg19则被一并包进囊泡, 进入液泡[62,63]。最近有研究发现, Ams1的受体除了Atg19外, 还有另外一个受体Atg34; Atg34是Atg19的同源物, 在饥饿条件下作为Ams1的受体, 使Ams1通过宏自噬进入液泡[64]。3.2 线粒体自噬(Mitophagy)

特异降解线粒体的选择性细胞自噬称为线粒体自噬。线粒体是细胞内物质新陈代谢的主要细胞器,为细胞提供能量, 同时也是细胞内ROS(Reactive oxy-gen species)的主要来源。ROS可以造成线粒体的进一步损伤, 这种损伤线粒体的累积会打破细胞内的生理平衡, 因此及时清除这些受损伤的线粒体, 维持线粒体的正常功能与数量对细胞内生理平衡是至关重要的。线粒体自噬是一种选择性细胞自噬, 除了需要细胞自噬共用的蛋白之外, 也需要一些介导特异性的蛋白。在2009年Klionsky和Ohsumi两个实验室同时发现Atg32是线粒体自噬的关键蛋白。Atg32位于线粒体外膜上, 可以作为线粒体的受体与Atg11相互作用, 定位于PAS, 之后与Atg8-PE相互作用, 负责自噬体的形成[65,66]。Atg32在线粒体自噬中的作用类似于Atg19在Cvt途径中的作用。3.3 过氧化物酶体自噬(Pexophagy)

过氧化物酶体负责脂类代谢与细胞内过氧化物的降解, 其生成与降解受到严格的调控。酵母可以通过

836细胞自噬降解多余及受损伤的过氧化物酶体, 根据降解形式的不同分为过氧化物酶体宏自噬(Macropexophagy)和过氧化物酶体微自噬(Micropexophagy)[67]。研究过氧化物酶体自噬最常用的模式生物不是酿酒酵母,而是另外两种生有大量过氧化物酶体的酵母: 在Pichia pastoris与Hansenula Polymorpha中, 细胞可以利用甲醇作为唯一的碳源生长; 当将碳源从甲醇换为乙醇或葡萄糖时, 过氧化物酶体便会过剩, 这时就会发生自噬以降解多余的过氧化物酶体。同Cvt途径一样, 过氧化物酶体自噬也需要Atg11。除此之外,Pex14是细胞自噬赖以识别过氧化物酶体的表面标志, 而Pex3必须被去除才能使过氧化物酶体被吞食[68,69]。这一过程中相应的受体蛋白是Atg30, 它连接Atg11与Pex14[70]。

4 酵母中研究细胞自噬的主要手段

经过二十多年的积累, 研究人员发明了丰富多样的针对酵母细胞自噬的检测手段, 其中常用的主要有以下几种:

4.1 Western blot检测Atg8以及降解的Atg8的量

用这种方法检测细胞自噬是因为部分Atg8位于自噬体的内膜, 随同自噬体一同进入液泡降解, 通过对比降解的Atg8的量便可知道形成的自噬体的量, 进而知道细胞自噬发生水平的高低。这种方法一般是在Atg8的N端连上标签蛋白, 如绿色荧光蛋白GFP;当自噬体与液泡融合后, 其内含物被释放进液泡被水解酶降解, 包括GFP-Atg8; 由于GFP结构域的稳定性比较高, 会单独存在一段时间, 因而可以通过West-ern blot检测GFP的条带来衡量降解的GFP-Atg8的量, 间接检测细胞自噬发生水平的高低。此外, 用荧光蛋白做标签, 也可以通过荧光显微镜观察Atg8的定位。

4.2 Pho8Δ60测定法

Pho8Δ60测定法也称ALP(alkaline phosphatase)测定法。PHO8是酵母液泡中碱性磷酸酶的唯一编码基因, 是一类II型跨膜蛋白。它首先以无活性的前体形式在内质网被合成, 而后经过高尔基体转运至液泡。在液泡中, 其C端的肽段被液泡内的水解酶切掉, 成为有活性的碱性磷酸酶。其N端的60个氨基酸构成包括跨膜结构域在内的转运信号, 负责前体Pho8一步步的转运。为了利用Pho8来检测细胞自噬的水平, 人们将其N端的60个氨基酸去掉[71], 故叫做Pho8Δ60测定法。这样处理之后的Pho8Δ60蛋

·特约综述·

白无法进入内质网, 只能分散在胞质中; 而当发生非选择性细胞自噬时, Pho8Δ60便会被包进自噬体, 从而到达液泡并被激活。这样便可通过碱性磷酸酶的酶活性来定量检测细胞自噬发生的水平。除此之外,还可以通过将Pho8Δ60与靶向特异细胞器的蛋白相融合, 利用这种方法检测此细胞器的特异性降解情况[72]。

4.3 Western blot检测mApe1的量

PrApe1是Ape1的前体形式, 它存在于细胞质中,没有活性。在正常条件下它大部分通过Cvt途径进入液泡; 而在饥饿条件或其他压力状态下, 它也会随细胞质通过非选择性的细胞自噬进入液泡成为成熟的mApe1。这样我们可以通过Western blot检测成熟的mApe1的量来评估细胞自噬发生的水平。4.4 显微镜观察

显微镜观察也是细胞自噬研究中常用的手段。细胞自噬的研究起点便是从用显微镜观察到自噬体而开始的, 随后显微镜在细胞自噬的研究进程中起了很大作用: 从电子显微镜观察自噬体的形态、大小、基本位置, 到荧光显微镜观察自噬相关蛋白的定位、分布, 这些都给科研人员提供了非常有用的实验数据。如在电子显微镜下, 可以观察到自噬体、液泡、液泡中的自噬小体(Autophagic body)等结构, 便于直观把握实验结果。由于电子显微镜样品的制备比较复杂, 这一技术通常在其他方法已有明确结果时用于进一步的确认。现在应用比较广泛的是荧光显微镜技术。例如, 用GFP标记Atg8, 便可以通过荧光显微镜观察Atg8的运动, 掌握细胞自噬的动态变化[48]。Atg9被认为是一种“膜载体”, 用荧光蛋白标记Atg9便可以检测其在PAS与外周膜结构之间的循环运动, 如当敲除ATG1、ATG2或ATG18时, Atg9便会聚集在PAS位点, 说明他们与其返回外周膜结构相关[32,39]。

5 小结

细胞自噬是真核细胞的一个基本功能, 它在维持细胞内生理平衡的过程中起关键的作用。研究表明,细胞自噬的缺陷与人类多种疾病密切相关, 暗示细胞自噬有可能成为治疗疾病的一个新的靶点; 各种有重要生理意义的选择性细胞自噬途径的发现更加强了人们对细胞自噬的兴趣。以酵母为模式生物开展的分子遗传学研究为揭示细胞自噬的奥秘提供了开启第一扇大门的钥匙; 在酵母中发现的分子机制大多可以应用到包括哺乳动物在内的多细胞生物中。我们

王海燕等: 酵母中细胞自噬的研究进展希望本文对酵母中的研究成果的介绍能对初入细胞自噬研究领域的研究人员有一定的参考作用。细胞自噬是当前细胞生物学领域发展势头最快的研究方向之一。随着近年来大量高水平的实验室进入这一领域, 关于细胞自噬的知识积累也呈现出爆炸性的增长

[73]

。可以预见, 在接下来的几年中, 自噬体膜的

来源、自噬体膜的扩展成熟机制、针对细胞自噬的药物开发等方面将会有突破性的进展; 而这些突破又会给细胞自噬的研究提出新的问题, 使细胞自噬领域的研究呈现出更加绚丽夺目的面貌。

本实验室的研究受国家自然科学基金面上项目30971441支持, 在此我们对国家自然科学基金委员会致以诚挚的谢意。

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Hai-Yan Wang1, Tao Ni2, Zhi-Ping Xie1*

(1School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China;

2

College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China)

Abstract Autophagy is a highly conserved subcelullar degradation process in eukaryotes. By eliminatingobsolete or damaged cytoplasmic materials, autophagy is critical in maintaining intracellular homeostasis understress conditions. In multi-cellular organisms, autophagy plays important roles in development, immune defense,programmed cell death, tumor suppression, and prevention of neurondegeneration. Studies using yeast model sys-tems have been instrumental in unlocking the molecular secrets of autophagy since the early 90s; and they remain amajor source of new discoveries in the field of autophagy related research. Here we provide a summary of ourcurrent knowledge of autophagy in yeasts and a brief introduction to frequently used assays.

Key words autophagy; molecular mechanism; yeast; assay

*Corresponding author. Tel: 86-22-23499550, E-mail: [email protected]