质粒的分子生物学与质粒载体

第三章 质粒的分子生物学与质粒载体

一、填空题

1． 基因工程中有3种主要类型的载体：——-------、------------一、-----------.

2.由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。

3.质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点区开始的。然而，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。在杂种质粒中，每个复制子的起点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。

4.就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。

5.如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。

6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。

7.复制子由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------————(3)—--------------—。

8.酵母的2μm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。

9.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。

10.pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于----——，它的四环素抗性基因来自于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来自于—---------—。

11.质粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过—------—恢复该基因的性状。

12.ColEl质粒复制的起始需要三种酶，即—-----------—、一------------和一------。

13．YAC的最大容载能力是—-----------—，BAC载体的最大容载能力是—---------—。

14．pSCl01是一种---------——复制的质粒。

15．把那些没有可检测表型的质粒称为—--------------—。

16．转座子主要由下列部分组成：(1)—-----————————(2)---------------——

(3)—----------------—。

17．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过——---------和——两种质粒改造而来。它的复制子来自—----------—，Amp抗性基因则是来自—--------—。

18．在基因型的表示中，符号Ω表示—-----------—；符号△表示—--------------—。

二、判断题

1． 迄今发现的质粒DNA都是环状的。

2． 线性质粒同环状质粒一样都不带有宿主必需的基因。

3． 有a、b、c三个质粒，因为a和b能够共存于一个细胞，a和c也可共存于同一个细胞，所以b和c一定能够共存于同一个细胞。

4． 插入元件(1S)也是一种转座元件，它除了有转座酶基因外，还有附加基因。

5． 如果两个不同的质粒可以稳定地共存于同一个细胞中，这两种质粒则属于同一个不亲和群。

6． 一个带有反向重复序列的双链DNA经变性后，复性时其单链可形成发夹环。

7． 能够在不同的宿主细胞中复制的质粒叫穿梭质粒。

8． 任何一种质粒都可以用氯霉素扩增的方法，增加它的拷贝数。

9． 只有完整的复制子才能进行独立复制，一个失去了复制起点的复制子不能进行独立复制。

10．CsCl-EB密度梯度离心法纯化SC DNA原理是根据EB可以较多地插入到SC DNA中，因而沉降速度较快。

11．质粒ColEl同pSCl01共整合后，得到重组质粒pSCl34，具有两个复制起点，这两个起点在任何细胞中都是可以使用的。

12．pBR322可以用于黏性末端连接、平末端连接和同聚物接尾法连接，无论用哪种方法连接，都可以用同一种酶回收外源片段。

13．所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。

14．一般情况下，质粒既可以整合到染色体上，也可以独立存在。

15．ColEl是惟一用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选择。

16．某一染色体DNA经内切酶SalI切割后，产生了若干个具有黏性末端的DNA片段，将这些片段分别在T4 DNA连接酶的作用下自身连接成环，然后导人受体细胞，都可以进行独立地复制。

17．如果细菌的某种表型特征在UV处理下丧失后不再恢复，这种表型有可能是质粒赋予的。

18．基因克隆中，低拷贝数的质粒载体是没有用的。

三、选择题(单选或多选)

1． 线性质粒复制的引物来自于( )

(a)细胞中合成的小分子RNA

(b)自身末端的端粒序列

(c)外加的寡聚DNA

(d)自身断裂的小分子DNA

2． 下面关于松弛型质粒(relaxedplasmid)性质的描述中，( )是不正确的

(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数 (b)可以在氯霉素作用下进行扩增

(c)通常带有抗药性标记

(d)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子

3． 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有( )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体

(a)pBR322 (b)pSCl01

(c)pUBll0 (d)pUCl8

4． 下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?( )

(a)质粒

(b)黏粒

(c)酵母人工染色体(YAC)

(d)λ噬菌体

(e)cDNA表达载体

5． 反向重复序列：( )

(a)可以回折形成发夹结构 (b)可以是某些蛋白的结合位点

(c)参与转座子的转座 (d)12 1-说法都不对

6． 松弛型质粒： ( )

(a)在寄主细胞中拷贝数较多 (b)可用氯霉素扩增

(c)一般没有选择标记 (d)上述(a)、(b)两项正确

7． ColEl是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒： ( )

(a)是松弛复制型 (b)具有四环素抗性

(c)能被氯霉素扩增 (d)能产生肠杆菌素

8． 同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )

(a)OC DNA>SC DNP>LDNA (b)SC DNA>L DNA>OC DNA

(c)L DNA>OC DNA>SC DNA (d)SC DNA>OC DNA>L DNA

9． pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自：( ) (a) ColEl (b)Ri质粒 (c)pSCl01 (d)pUCl8

10．关于质粒的相容性，下面哪一种说法不正确? ( )

(a)不同相容群的质粒能够共存于同一个细胞

(b)质粒可以分成若干个不相容群，但不能分成若干个相容群

(c)如果a、b两种质粒不相容，说明它们的复制机制相同

(d)属于同一个不相容群中的质粒，不仅复制机制相同，而且拷贝数和分子量也相同

11．关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?( )

(a)在不同的宿主中具有不同的复制机制

(b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点

(c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶

(d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率

12．能够用来克隆32kb以下大小的外源片段的质粒载体是( )

(a)charomid (b)plasmid (c)cosmid (d)phagemid

13．第一个作为重组DNA载体的质粒是( )

(a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8

14．Ti质粒：( )

(a)可从农杆菌转到植物细胞中

(b)作为双链DNA被转移

(c)在植物中导致肿瘤

(d)介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素

(e)需要细菌的vir基因帮助转移

(f)在植物细胞中作为染色体外质粒

四、简答题

1． YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？

2． 列举质粒载体必须具备的4个基本特性。

3． 什么叫穿梭载体?

4． 说明减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理。

5． 虽然质粒的带动转移给质粒载体的安全性带来一定的困难，但是通过带动转移将质粒转移到特定的受体菌中也是基因工程中常用的实验技术。请举一例说明之。

6． 为什么来自HfrⅹF的重组体几乎总是F-?

7． 解释为什么不同的Hfr菌株具有不同的转移起点和方向?

8． 怎样从一个E．coli的Hfr菌株中分离到一个F′gal+-的菌株?

9． 你已经分离了一个新的F因子， 怎样用最简便的方法知道最初的F因子的部分DNA已经被切除，并被一个外源DNA(也就是细菌DNA)所替代?

10．你能用哪一种基因转移的方法确定

(1)Kcoli染色体上一个新发现的基因座在其染色体上的位置；

(2)一个新分离的突变在基因内的位置。

11．用加有注释的图表说明F质粒是怎样从一个P细胞转移到F细胞。并简要说明转移复制如何不同于营养体的复制。

五、问答题

1． 什么是复制子(replicon)?

2． 什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么?

3． 什么是质粒的带动转移?

4． 说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理。

5． ColEl衍生质粒拷贝数调节机理的机理是什么?

6． R1质粒拷贝数受到怎样的调节控制?

7． 质粒如何维持在细胞中的稳定?

8. 引起质粒不相容性的主要原因是什么?

9． 由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?

10．请指出质粒pSCl01的一些生物学特性(包括结构和遗传)及在基因工程中的作用。

11．自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColEl和pSCl01这两个自然质粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造包括哪些基本内容?

12．质粒改造的发展过程如何?

13．在质粒中如何增减酶切点?

14．有人用限制性内切核酸酶EcoRl分别切割松弛型质粒ColEl和严紧型质粒pSCl01(各有一个切点)，然后重组连接形成一个杂种质粒pSCl34，请推测这种质粒有什么特性和用途。

15．现分离了4种新的大肠杆菌Hfr菌株，通过中断接合实验，针对每一菌株确定了高频转移的标记基因和它们进入F受体的时间分别为：

Hfrl Hfr2 Hfr3 Hfr4

man 13min mal 29 lys 16 pur 6

标记基因和第一 trp 6 met 14 arg 9 trp 3

次进入的时间 his 23 thr 4 mal 2 thr 31

pur 3 uvr 20 his 32 lac 23

gal 14

(gal、lac、mal、man不能发酵半乳糖、乳糖、麦芽糖和甘露糖；arg、his、met、trp：生长需要精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、嘌呤和色氨酸；uvr： 紫外线敏感)。任何没有给出的标记都是不能高频转移的。上述数据能够说明大肠杆菌的染色体是环状的吗?以分钟表示图距构建一个大肠杆菌染色体的连锁图。假定整个染色体用了100分钟转移，而且苏氨酸被认为位于0分钟或100分钟处。

16．YAC克隆载体常出现哪些问题?