半数致死量的测定
半数致死量的测定
半数致死量(LD 50)是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志。它表示能使全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。
由于生物间存在个体差异性,因此 LD50需用一批相当数量的实验对象进行实验方能测得,并且每种药物不同实验对象的 LD50值不相同。
测定 LD50的方法很多,如目测机率单位法、直线回归法、累计法及序贯法等。由于寇氏法较常用,并有计算简便,结果较准确等特点,故专门介绍之。
【目的】用寇氏法测定敌百虫对小白鼠的经腹腔注射的 LD50和95%可信限。
【方法】寇氏法( Karber法 )
【条件】
1. 剂量必须按等比级数(剂量对数按等级数)分组。
2. 各组动物数应相等。
3. “反应”应大致呈正态分布。最小剂量组的死亡率(Pn )应为0%,最大剂量组的死亡率(Pm )应为100%;
如果 Pn80%需用校正公式计算;如Pn>20%或Pm
则不能用此法计算。
【步骤】
1. 预备实验
(1)摸索上下限:即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量(Dm )和一个动物也不死亡的最大剂量(Dn )。
方法是据经验或文献定出一个估计量,观察 2~3只动物的死亡情况。如全死,则降低剂量;如全不死,则加大剂量再行摸索,直到找出Pm=100%和Pn=0%的剂量,此两量分别为上下限。
(2)确定组数,组距及各组剂量
①组数:一般5~8组,可根据适宜的组距确定组数,如先确定5组,若组距过大,可再增加组数以缩小组距。有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。
②组距:指相邻两组剂量对数之差,常用“d ”来表示。D 不宜过大,因过大可使标准误增大;也不宜过小,因过小则组数增多,各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者,死亡率随剂量增加(或减少)而增加(或减少)的幅度大,组距可小些;反之,敏感性小者,死亡率随剂量变化的幅度小,则组距应大些。上下限之间的距离可作为敏感性大小的标志。距离大,说明敏感性小;距离小,则说明敏感性大。一般要求d 应小于 0.155,多在 0.08~0.1之间。 ③确定组距方法:把上下限的剂量换算成对数值,设上限剂量的对数值为 XK ,下限剂量的对数值为X 1,组数为G ,则:d =(X K -X 1)/(G-1)
④确定各组剂量:由X 1逐次加d (或由X K )逐次减d ),得出各组剂量的对数值,再分别查反对数,即得出各组剂量(呈等比级数排列)。
(3)配制等比药液,并使每只动物在给药容量上相等(如 0.5ml/20g )。
2. 正式实验
(1)实验动物的选择与分组
①选择原则:可根据不同实验而选取动物,应选择对被试因素敏感的动物。同时也应考虑动物来源,经济价值及操作简便等条件。LD 50常用小白鼠进行实验来测得。
②分组原则:每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数,就不能充分反映各组死亡率的差别。(如共8组,每组10只动物,高剂量三个组的死亡数分别为6、9、10,但如果每组只用6只动物,则高剂量三个组的死亡数可能都是6。)
③分组方法:见附录,实验对象分组法。首先,按性别将动物雌雄分开或各半混合编组,然后按体重分群,再随机分组,为求使各组平均体重相等。
(2)给药、观察死亡数、求出死亡率
①给药途径:可据不同药物及动物而定,小白鼠多用腹腔注射或灌胃法;也可静脉注射。 ②给药顺序:宜采取间隔跳组方法。如共7组,先按2、4、6 组顺序给药,然后逆行按7、 5、3、1组的顺序给药。这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。而且当第3组给药后,如第2组动物已经全死,则可省下第1组动物及1号药液。如第7组已死亡,可补做第8组,争取做出0%死亡率的组来。每只动物的给药容量可按个体体重或平均体重确定。
③观察时间:直到动物不再因药物作用而死亡为止。在观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件,严防非被试因素引起的死亡。
最后将死亡情况及各种数据填入下表中。
LD 50计算表:
3. 计算公式
①基本公式 lg LD50=X K -d(∑P-0.5)
式中:X K 死亡率为100%组的对数剂量
d 对数组距
∑P各组死亡率之和
②校正公式
当Pm>0.8或Pn
lg LD50=X K -d(∑P
-1③ LD50=lg lgLD 50,单位应换算成mg∕kg 或g∕kg表示。
④ 95%可信限:
LD 50±4.5S ㏒ LD50·LD 50
S ㏒LD50 =d√∑p(1-p )/(n-1)
式中:S ㏒ LD50是 ㏒ LD 50 的标准误
P 各组死亡率
n 每组动物数
【测定 LD 50 的原理及公式来源】
为了解LD 50测定原理,首先需了解剂量与反应的关系。某被试因素对动物的毒性也是一种反应,其大小往往以其使动物致死的量表示。致死量小说明毒性大,反之说明毒性小。根据剂量与反应的关系,可绘出剂量反应曲线(量效曲线)。图中表示的是以死亡频数和死亡率为反应指标的质反应量效曲线,它们具有如下特点:
1. 剂量与死亡频数的关系:是一条中间高,两侧低,右侧延长较远的曲线(图 5-a)
2. 对数剂量与死亡频数的关系:是正态分布曲线(图 5-b)
3. 剂量与死亡率的关系:是一条长尾“S”形曲线(图 5-d)
4. 对数剂量与死亡率的关系:是一正“S”形曲线(图 5-c)
从对数剂量与死亡频率的正态分布中(5-b )可见,lg LD50恰在正态曲线中点所对应的横轴上,按此剂量给药动物恰好死亡一半。因在正态曲线中,其中点恰是均数所在处,所以lg LD50就是全部实验动物最小致死剂量对数的算术平均值(也是真数剂量的几何平均值)。
从对数剂量与死亡率关系的正S 形曲线(图 5-c)中可见,lg LD50恰为正S 形曲线中点所对应的横轴上的对数值,因此正S 形曲线中点对应的纵轴(死亡率)恰为50%。这条曲线的特点是:①死亡率为50%(即LD 50)时的斜率最大,由于其位于曲线中央,故灵敏度最高。②曲线两端平坦,接近0%或100%附近灵敏度最差,剂量不易确定,而且即使确定了也常不可靠。所以采用半数致死量做为判定某因素毒性大小的指标是恰当的。总之,如果求出正态曲线中点所对应的横轴上的对数值或正S 形曲线中点所对应的横轴上的对数值,即可求出lg LD50及LD 50。
公式推导:根据对数剂量与死亡率关系的量数曲线,通过面积法可得出公式:
lg LD50=XK –d ∑(P i –P i+1)
/2
图中横坐标为对数剂量X ,纵坐标为死亡率P ,G 为正S 形曲线中点,它对应的纵坐标H 点P =50%,横坐标F 点X =lg LD50,A 点P =0%=0,D 点P =100%=1,B 点X K 为P =100%的对数剂量。
由图可知:矩形AFED =AF×AD=lg LD50×1=lg LD50
又:曲边△X1FG ≌曲边△GCE(二边一角相等)
∴矩形AFED =曲边形AX 1CD =lg LD50 则lg LD50=矩形AX K CD -曲边形X 1X K C 。 ∵曲边形X 1X K C 相当于多个梯形面积之总合。 ∴曲边形X 1X K C =d×∑(Pi +Pi+1)/2 又矩形 AXK CD =AX K ×XK C =X K ×1=X K ∴lg LD50=X K -d∑(Pi +Pi+1)/2 上述推导过程用直观图表示: