[PDF] 无机纳米粒子作为基因载体的研究进展

文章编号： 1004-0374(2008)03-0402-06

无机纳米粒子作为基因载体的研究进展

李新新，侯 森，冯喜增*

（南开大学生命科学学院，生物活性材料教育部重点实验室, 天津 300071）

摘　要：转染是将具生物功能的核酸转移、运送到细胞内，并使其在细胞内维持生物功能的过程。作

为现代生物化学和分子生物学中的一种主要技术手段，转染对于基因治疗有重要的意义。无机纳米粒子作为基因载体受到人们日益广泛的关注，其具有易于制备，可进行多样化的表面修饰等多种优势。本文将概述无机纳米粒子作为基因载体的现状及其对基因表达的影响。关键词：转染；无机纳米粒子；基因载体；基因治疗中图分类号：TN383；Q782；R394　　文献标识码：A

Progress of inorganic nanoparticles as gene delivery vectors

LI Xin-xin HOU Sen FENG Xi-zeng*

(The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, College of Life Science, Nankai University,

Tianjin 300071, China)

Abstract: Transfection is defined as the delivery of functional nucleic acids into living cells, maintaining thebiological function of the nucleic acids. As an important technique in biochemistry and molecular biology,transfection is meaningful for its potential applications in gene therapy. Inorganic nanoparticles can be used asgene delivery vectors and have received extensive interest due to their various advantages, such as easypreparation and surface-functionalization. This paper reviewed the current researches about inorganicnanoparticles as gene delivery vectors. Their influence on the gene expression was also discussed.Key words: transfection ；inorganic nanoparticles；gene vectors；gene therapy

转染可将核酸(DNA、RNA 或者寡核苷酸) 转运到活细胞中并使其在细胞内发挥生物功能[1]。该过程涉及细胞外分子通过胞膜被摄取并被转运到细胞核中。这种引导遗传序列进入哺乳动物细胞的方法是分析基因结构、功能和调控的必要工具，也是基因治疗技术的理论基础。该技术为先天性遗传疾病和严重后天获得性疾病的治疗提供了一条富有前景的新途径。

目前常用于基因转染的载体系统包括两类: 非病毒基因转运体系和病毒基因转运体系。非病毒基因转运体系的方法包括电穿孔、显微注射、基因枪、重组蛋白、各类聚合物、无机纳米粒子等[2]。其中无机纳米粒子作为基因载体具有其显著的优点：纳米粒子能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；比表面积大，具有生物亲和性，易

于在表面耦联特异性的靶向分子；在循环系统中，其循环时间较普通颗粒明显延长，不会象普通颗粒那样迅速地被吞噬细胞清除；能够使核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，维持有效的产物浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度；代谢产物少，副作用小，无免疫排斥反应等。因此, 近年来人们对无机纳米粒子基因载体的发展给予了很多的关注，对如何提高其转染效率也做了大量的研究。1　无机纳米粒子基因载体转染的机理

无机纳米粒子主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生物体中而起到治疗疾病的作用[3]，

收稿日期：2008-04-14；修回日期：2008-05-07基金项目：国家自然科学基金重大项目（90403140）*通讯作者：E-mail: [email protected]

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其发挥转染功能的大致过程如下(图1) ：首先，将DNA 和RNA 等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过内吞入胞等方式被转运至细胞内并且被释放。在该过程中，如果DNA 不能及时从内涵体中逸出，就会被溶酶体酶降解(溶酶体中的pH 值低于5) 。此外，当DNA 被释放到细胞质中后，一些特定的酶(核酶) 同样会降解DNA 。为此，转运过程必须克服上述的种种障碍。其次，将DNA 导入细胞核并发挥功能。一般来说，分子都是通过核孔复合物进入细胞核。核孔复合物是一个插入到双层核膜中的蛋白质大分子，允许大约9 nm的溶质自由通过。生物大分子或纳米粒子通过核孔则需要信号介导的转运分子：这些分子或纳米粒子必须携带核定位序列才能与转入子a 结合，形成的复合物再触发结合转入子b ，在GTP 酶——Ran 的协助下通过核孔复合物进入细胞核。尽管对核定位进行了大量的研究，但仍无法确定DNA 进入细胞核的途径。例如：人们对于DNA 是单独进入细胞核还是与纳米粒子整合后一起进入细胞核仍无定论。尽管如此，人们主要倾向于两种主要理论：一种是纳米粒子在内涵体或细胞质中被溶解，然后释放DNA 转运进核；另一种是携带DNA 的纳米粒子直接到达细胞核表面，然后DNA 转运进核[4]。2　无机纳米粒子作为基因载体的细胞转染研究进展

无机纳米粒子作为基因载体，其转染效率虽低于病毒载体，但由于其具有无免疫原性，能免受病原菌的侵袭、低毒、装载容量大、稳定性高、易于储存、制备容易等优势而引起广泛关注。应用于基因转运的无机纳米粒子主要包括硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、层状双氢氧化物、金属纳米粒子、量子点等(图2) 。

2.1　硅作为基因载体 　将硅烷醇修饰在硅纳米粒子表面可以很容易使其功能化。硅纳米粒子的这种修饰特性与硅自身高的生物相容性使其能用于转染。经氯化钠修饰后的硅纳米粒子的直径为10—100nm ，其转染效率为70%，且无细胞毒性。将该硅纳米粒子对鼠进行实验发现细胞没有发生病理性的改变[5]。壳核型二氧化硅经过表面氨基化可作为非病毒型基因载体，并能保护所转运的基因免受核酸内切酶的降解。Radu 等[6]报道了内部包埋绿色荧光蛋白、外部结合聚酰胺-胺(PAMAM)的介孔硅纳米微球作为基因载体在生物技术中有广阔的发展空间。使用介

图1　纳米粒子进入细胞和细胞核的机制

Ⅰ: 纳米粒子复合物吸附在细胞膜表面；Ⅱ: 通过内吞摄取；III-Ⅳ: 复合物从内涵体中逸出并且在细胞内释放；Ⅴ:

基因进入细胞核

图2　不同类型的纳米粒子作为基因载体孔粒子作为基因载体时，可将染料分子插入介孔中，通过荧光显微镜跟踪纳米粒子在细胞内的转运通路。进一步研究发现这些纳米粒子被转运到细胞质中，并没有进入细胞核，这一事实强调了核膜对纳米粒子的屏障作用。

Luo 和Saltzman [7]发现未功能化的硅纳米粒子通过将DNA 吸附在细胞表面可以作为细胞吸收DNA 的介质，并根据这一发现建立了一种模型系统。在该系统中，硅纳米粒子(粒径大概为225nm) 在转染试剂存在的情况下增加了细胞表面的DNA 浓度，进而显著提高了转染效率。进一步研究表明，其转染效率的增加直接与沉淀的比例相关，粒径非常小或低密度的纳米粒子不能表现转染活性。除此之外，研究还发现纳米粒子的化学组成对转染效率没有影响，也就是说，DNA 吸收量的增加受机械力学影响[8]

。

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2.2　铁氧化物作为基因载体　在非金属无机材料中，磁性纳米材料最为引人注目，其已成为目前新兴生物材料领域的研究热点。磁性纳米粒子表现出良好的表面效应，比表面激增，官能团密度和选择吸附能力变大，携带药物或基因的百分数量增加。陈道桢等[9]研究了PEI-氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的可行性及外加磁场对于其转染效率的影响。PEI-氧化铁磁性纳米颗粒的DNA 结合实验证实，其具有良好的结合DNA 功能。体外基因转染实验发现，PEI-氧化铁磁性纳米颗粒能将PGL2-控制的质粒DNA 导入肿瘤细胞中，进而表达荧光素酶，而外加磁场后转染效率可增加几倍。Cheng 等[10]利用Fe 2+、 Fe3+和四甲基氢铵氢氧化物制备了直径为9nm 的磁铁矿纳米粒子。将该纳米粒子在Cos-7猴肾中进行实验，结果显示在不同的磁铁矿剂量条件下，其都没有毒性。

研究发现磁性氧化铁与适宜的表面修饰共同作用可以提高其生物相容性和功能稳定性。Bruce 等[11]制备了硅修饰的磁铁矿纳米粒子并且用胺基团使其功能化，可将寡核苷酸共价结合到胺基团上。Plank 等[12]提出了磁转换的理论，并发现了经过转染试剂和超顺磁粒子处理以及外加磁场的作用后，细胞对DNA 的吸收显著加强了。Guptaet 等[13]研究了表面修饰后的超顺磁氧化铁纳米粒子与细胞间的相互作用力。未功能化的氧化铁纳米粒子本身具有毒性(破坏细胞骨架结构) 。然而，当其被曲霉多糖(一种从酵母中提取的多糖) 功能化之后就失去了副作用[14]。该研究结果揭示了纳米粒子表面对于其执行生物功能的重要性。此外，研究表明巨噬细胞对聚乙二醇-功能化后的磁铁矿纳米粒子的吸收明显多于未功能化的纳米粒子，然而，对于乳腺癌细胞来说，实验结果正好相反。显然，当细胞吸收纳米粒子时，对粒子表面的亲水性不同的细胞系表现出了不同的选择性。

2.3　碳纳米管作为基因载体　继1991年Iijima 发现碳纳米管之后，其特殊的结构、机械性能和化学性质使得碳纳米管受到了很多研究者的青睐[15]。通过研究得到了两种类型：单壁碳纳米管和多壁碳纳米管[16]。事实上，碳纳米管在生物环境(水环境中) 中是不溶的，只有用聚合物修饰表面使其功能化后才能增加其水溶性。碳纳米管的化学惰性以及可选择的功能化修饰或者其管内可以装载生物分子的能力，使得其有可能成为最有潜力的基因载体[17]。

Liu 等[18]证明碳纳米管与siRNA 共价结合使其功能化后可以高效地将这些核酸转运到人T 细胞中。然而，碳纳米管不能降解，无法确定其在细胞中的去向。因此必须在其未降解的情况下，用一种适宜的的机制将其提取出来。研究发现，对于各种哺乳动物细胞系来说，碳纳米管具有毒性。Jia 等[19]发现按照单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、石英、C 60的顺序，细胞毒性逐步降低。现在的研究热点主要集中在增加碳纳米管的水溶性以及降低其毒性从而得到一个更好的转运体系等方面。

2.4　磷酸钙作为基因载体　磷酸钙都以碳酸化羟基磷灰石的形式出现。除搪瓷以外，磷酸钙都呈现为纳米粒子的形式。其具有很好的生物相容性，并且无细胞毒性，因此可以作为核酸载体。Yang 等[20]用磷酸钙纳米粒子作为基因载体，诱导了鼠牙髓干细胞中骨成形素蛋白2的转染。实验结果表明结合了质粒D N A 的磷酸钙纳米粒子转染率很高。Kakizawa 等[21]制备了嵌段-共聚物/磷酸钙纳米粒子组装体并且用于细胞转染。Olton 等[22]用沉淀法制备了单分散的磷酸钙纳米粒子并得到了最高的转染效率。Bhakta 等[23]制备了大小为100—30 nm的磷酸镁和磷酸锰纳米粒子，其都能与DNA 结合而实现功能化。Brash 等[24]研究了磷酸锶纳米粒子的制备和表征，以及其在瞬时和稳定转染方面的应用。掺杂-铕的磷酸钙纳米粒子具有荧光现象并且可以观察纳米粒子在胰腺细胞中的转运通路。同理也有可能制备掺杂-铕(红色荧光) 和掺杂-铽(绿色荧光) 的磷酸钙纳米粒子。两者都能通过DNA 进行胶状固定，其不仅容易被细胞吸收，而且会呈现非常高的内在结晶度，从而给出一个合适的荧光信号[25]。标准磷酸钙的沉淀条件对于细胞转染效率具有决定性作用。主要的参数包括pH 值、CaCl 2 和 DNA的浓度、温度以及沉淀与转染的时间。随着时间的延续，未受到完全保护的纳米晶体体积会增大进而形成一个大分子晶体，其转染能力会随之消失。当然，磷酸钙的转染效率在很大程度上也取决于细胞的种类。Orrantia 和Chang [26]跟踪了32P-标记DNA 在细胞中的转运通路并作出以下结论：胶体(主要是粒径的大小) 的形态和免受核酸酶降解的保护行为在提高转染效率方面起着关键作用。然而，磷酸钙纳米粒子降解后会增加细胞内钙的浓度，从而对细胞会造成损伤。因此，磷酸钙在细胞质中被降解之前，必须将其从细胞中提取出来。磷酸钙纳米粒子还存在的

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一个问题是装载有DNA 的纳米粒子在运往细胞核的过程中会被降解。很多研究都阐明了磷酸钙/DNA共轭物运进细胞的通路。Straint 和Wyllie [27]发现不到7%的附加DNA 被转运到细胞质中，而少于4%的进入细胞核中，仅仅有0.5%的DNA 未被降解且仍有活性。他们研究发现磷酸钙多壳纳米粒子作为基因载体时，DNA 可以被包裹在粒子内部也可以分布在其表面。在粒子内DNA 可以不被降解，而分布在表面则可以作为一个保护层阻止聚合和沉淀，这样就可以显著增加转染效率。

2.5　金属纳米粒子作为基因载体　人们对金属纳米粒子，尤其是贵金属，如金、银、钯、铂等的化学特性进行了大量研究。金纳米粒子粒径大小通常为10—20 nm，其很容易被细胞吸收[28]。Liu 等[29]指出Au 55簇可以有效地与DNA 相互作用并能作为抗癌药物。该作用与粒径大小有关，粒径小的金粒子簇可以插入DNA 双链中。金的表面可以与硫醇共价连接，从而使其表面功能化，并且寡核苷酸也能连接到粒子的表面。Oishi 等[30]报道了由金纳米粒子组装成的聚合物纳米粒子，其表面被硫醇-寡核苷酸共轭物功能化。Mirkin 等[31]也将装载有寡核苷酸的金纳米粒子应用于基因沉默实验中。Salem 等[32]合成了由金和镍组成的二金属纳米杆并将其用于非病毒基因转运体系中。这些纳米杆中的金和镍能够选择性地结合质粒DNA ，然后靶向结合配基。Han 等[33]研究了对光不稳定的金纳米粒子作为基因载体以及光控的DNA 的释放。这种光感应性金纳米粒子的应用为基因治疗指引了新的方向。其具有灵活的表面修饰功能，而且载体-DNA 复合物具有很好的模序性。该金纳米粒子具有光敏的O-硝基酯键，能通过光来调节DNA 的释放。当其与DNA 结合后，在细胞外可以通过T7RNA 聚合酶抑制DNA 的转录，除此之外，还可以在哺乳动物细胞中获得很高的DNA 转运效率(图3) 。

2.6　层状双氢氧化物作为基因载体　层状双氢氧化物具有很高的负离子交换能力、高生物相容性、高化学稳定性等特性，因此在生物杂交纳米粒子领域受到了特别的关注。因其具有高效的粒子交换能力，插入其中的负离子可以用一系列带有负电荷的生物分子，如DNA 、维生素、药物和糖类进行置换。层状双氢氧化物释放有机分子的频率依赖于周围介质的pH 值和离子强度[34]。Choy 等[35]报道了一种生物分子-无机杂交体。该杂交体是一类负离子

图3　金纳米粒子作为基因载体

A ：细胞内在紫外光的照射下，D NA 从带正电荷的光裂解纳米粒子(NP-PC)-DNA 复合物中释放的机制；B ：光诱导的NP-PC 的表面变换

交换片层，并且带有负电荷，因此DNA 可以牢固的包装到该片层双氢氧化物中。此外，研究指出，如果该材料以纳米粒子的形式出现并包裹DNA ，则其可用作转染试剂并且具有很高的转染效率。2.7　量子点(quantum dots，QD) 作为基因载体　量子点是一种很小的纳米粒子，其粒径一般为几个纳米，这些粒子都是由II-VI 或 III-V半导体组成的，如CdS 、CdSe 、ZnS 、ZnSe 、ZnO 、GaAs 、InAs [36]。量子点具有优良的光学特性并已被开发用于生物医学成像[37]，Wang 等[38]发现半导体纳米杆中富含羧酸的纳米球可以用于细胞成像。近年来的研究显示，量子点也可以用于转染。Tan 等[39]合成了包裹CdSe/ZnS量子点的自跟踪壳聚糖纳米粒子，并且将其应用于siRNA 干扰实验中。Akerman 等[40]揭示了用特定多肽修饰的ZnS/CdSe量子点靶向转运到不同的细胞和器官的机制。Ni koli c 等[41]研究了CdSe/CdS、Fe 3O 4和CoPt 3量子点的聚环氧乙烷修饰。经过修饰，其在水中的溶解度显著增加。Lim 等[42]将一种新的无机／有机荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET) 协同量子点作为供体，将染料BOBO-3

作为受体，并且

406生命科学第20卷

图4　 QD-BOBO FRET系统的示意图

A ：用BOBO-3染料对生物素化后的双链DNA ，并将其作为FRET 系统的连接子；B ：链霉亲和素-功能化QD525局部浓缩染色后的生物素-双链DNA ，组成了一个QD-DNA 组装体；C ：通过在436 nm处激发QD ，能量从FRET 供体(QD525)转移到FRET 受体(BOBO-3)，并且在602 nm处观察FRET-介导的发射情况

将DNA 作为连接子，从而实现了对DNA 纳米复合物在细胞内转运的监控(图4) 。

II-VI 和III-V 半导体量子点(比如CdSe 、CdTe) 固有的毒性很大程度上限制了其在生物学方面的应用。量子点具有毒性的原因可能有两个：表面阳离子的存在(比如Cd 2+) 和光自由基的形成。Zhang 等[43]发明了一种可以增加量子点生物相容性的方法。首先，他们将CdSe/ZnS核-壳量子点硅烷化，然后用聚乙二醇进行修饰。实验证明，这些表面修饰了的纳米粒子对细胞没有危害。3　结论

综上所述，无机纳米粒子作为基因载体具有显著优势和巨大的应用价值。无机纳米粒子浓缩及保护DNA 的作用、较大的核酸装载容量、优良的表面性质、极低的免疫原性赋予了其在基因转染领域巨大的应用潜力和广阔的发展空间。无机纳米粒子多样化的表面修饰能力不但能够显著提高自身的转染效率，而且能够在很大程度上改善其生物相容性，从而使无机纳米粒子作为基因载体的实用化成为可能。尽管无机纳米粒子作为基因载体的发展时间还不长，并且面临着许多问题尚待解决，但是无机纳米粒子作为基因载体在基因治疗领域已经崭露头角，而且受到人们日益广泛的关注。我们相信随着研究的深入，无机纳米粒子终将成为理想的基因

治疗载体而获得长足发展。

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