水中大肠菌群的测定
实验 水中大肠菌群的测定及结果分析
一、目的要求
1、学习测定水中大肠菌群检测程序、方法。 2、掌握大肠菌群检测结果的报告方式。 二、实验原理
大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活无水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时发酵乳糖并产酸才产气。食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number,简称MPN）表示。据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均以100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据数量的多少，判定食品受污染的程度。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过3个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 三、实验器材
1、培养基：乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管
2、器皿：1ml吸管、10ml吸管、试管（15×150）、三角锥瓶500ml、三角锥瓶500ml（内装蒸馏水250ml）
3、其他：酒精灯，牛皮纸或报纸，棉花，高压蒸汽菌锅，水浴锅，显微镜，香柏油，二甲苯等 四、操作方法
1、水样的采取
池水、河水或湖水 应取距水面10—15㎝的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2、检样稀释
（1）以无菌操作，将检样25mL放于含有225mL灭菌蒸馏水水的三角锥瓶中，摇匀，做成1：10的均匀稀释液。
（2）取一支lmL吸管插入吸取1∶10稀释液1mL注入含有9mL灭菌水的试管内，振摇试管，混合均匀，做成1∶100稀释液。
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（3）另取1ml灭菌吸管按上述操作顺序操作10倍递增稀释液，如此每递增稀释1次，即换用1支1ml灭菌吸管。
（4）根据对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管。
3、发酵试验
选择三个稀释度分别接种与乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，可用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，可用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置于（36±1）℃温箱内，培养（24±2）h ，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行检验。
4、分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于35～37℃温箱内，培养18～24h，然后取出观察菌落形态、并做革兰氏染色、镜检和乳糖复发酵试验。
5、复发酵证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于（36±1）℃温箱内，培养（24±2）h ，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 五、实验报告
填表，并根据实验证实为大肠菌群阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL大肠菌群的最可能数。
被检样品每100mL中大肠菌群细菌的可能数为：
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附表：
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实验安排：
1、在配培养基时，将乳糖胆盐发酵管和乳糖发酵管分别用针注满，沿着试管壁滑入试管中，试管内装有液体培养基，注意不要有气泡，试管分别为每组九个，共18个。试管包扎后灭菌。
2、第二次实验：取水样进行梯度稀释（用无菌水），分别为10、10、10。每个稀释度样分别于接种三个试管（带有导管），即九个试管。培养24h。
3、第三次实验：观察现象（产酸产气）和分离培养。将伊红美蓝培养基做好。将观察到的产酸产气的试管（9个中的）用接种针（环）取样接种于伊红美蓝培养基上（平板），进行培养。
4、第四次实验：在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色。 5、第五次实验：同时接种乳糖发酵管，置于（36±1）℃温箱内，培养（24±2）h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
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