显微镜直接计数技术
实验十二、显微镜直接计数技术
一、实验目的和内容
目的：明确显微镜计数的原理
内容：用血球计数板进行酵母菌的计数
二、实验原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积的一定的（0.1mm3）, 所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特别的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室内进行。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都昌相同的，即为16×25=400小方格。
三、实验材料和用具
菌种：酿酒酵母菌悬液
器材：血球计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细管
四、操作步骤
1．制备酵母菌的稀释液：取在麦芽汁斜面上培养48小时（在30下培养）的酵酒酵母菌1支，用10ml 生理盐水分两次将菌苔洗下，倒入含有玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，使细胞分散。该菌悬液经适当称释作为计数菌液。菌液应稀释到使每一中格平均有15~20个细胞数为宜。
2．洗血球计数板：先用自来水冲洗（切勿用硬刷子洗刷），再用95%乙醇棉球轻轻擦洗，最后用吸水纸吸干（切勿在煤气灯上烘烤！）经镜检确证计数板上无污物或粘附的微生物后才可使用。盖玻片也应用擦镜纸擦得干净而明亮。
⑴ 加菌液：将盖玻片盖在计数室上面，用细口滴管将菌液来回吹吸数次，使菌液充分混匀后立即吸取少量菌液加在盖玻片的边缘上，计菌液由盖玻片与计数板的缝隙间渗入计数室（计数室内不能有气泡）。再用镊子轻压盖玻片，以免因菌液过多将盖玻片顶起而改变了计数室的容积。静置片刻，待菌体自然沉降并稳定后，再开始计数。
⑵ 计数：先用低倍镜寻找大方格网的位置（视野宜调暗些），找到计数室后将它移至视野中央，再换高倍镜观察和计数。为了减少误差，所选的中格位置应布点均匀，通常取4个角上的4个中格及中央的1个中格，共5个中格进行计数。为了提高精确度，每个样品必须重复计数2~3次。
⑶ 清洗：计数完毕，计数板先用自来水冲洗，用吸水纸吸干后再用乙醇棉球轻拭，最后用擦镜纸擦干。盖玻片亦要洗净擦干，再放入盒中。
五、注意事项
直接镜检计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板。绝不能用硬物洗刷。洗后待其自行晾干或用滤纸沾干。最后用擦镜纸擦干净。