pGAP毕赤酵母表达系统研究进展

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

pGAP-毕赤酵母表达系统的研究进展

张建峰1，耿宏伟1，王丕武25 （1. 吉林农业大学生命科学学院，长春 130118； 2. 吉林农业大学农学院，长春 130118）

摘要：三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子具有很强的组成型表达能力，在近年来广泛应用于巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白。文中通过对pAOX1、pFLD1、pGAP 三种表达载体的比较，阐述了pGAP 表达系统在生产外源蛋白中的优点及国内外现阶段的相关应用。

关键词：pGAP ；巴斯德毕赤酵母；表达系统；外源蛋白

中图分类号：Q786

10

Research Progress on pGAP- Pichia Pastoris as a Gene

Expression System

ZHANG Jianfeng1, GENG Hongwei1, WANG Piwu2

15 (1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118;

2. Faculty of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118)

Abstract: The GAP gene promoter has a very strong constitutive expression ability，therefore, pichia pastoris has been widely applied to the expression of the heterologous protein in recent years. By comparing the three kinds of expression vector pAOX1, pFLD1 and pGAP, this paper elucidates the advantages are brought by the pGAP expression system during the producing of the heterologous protein as well as the related application at home and abroad.

Key words: pGAP; pichia pastoris; expression system; heterologous protein

20

0 引言

25 随着分子生物学技术的快速发展，越来越多的人开始关注利用微生物表达系统表达外源

蛋白。酵母是一种单细胞低等真核生物，特性是易于培养、繁殖快、利于基因操作，并且能对外源蛋白进行翻译后修饰和加工、适合高密度发酵、不产生有毒物质，逐渐受到了人们的关注，为外源基因在真核生物中的表达提供了广阔的前景[1]。

最先用于表达外源蛋白的酵母属是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 。1981年

30 Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功[2]。此后继续用该系统表达了其它多种真核和

原核蛋白，酿酒酵母表达系统逐渐成为分子生物学中研究的较为透彻的酵母表达体系[3]。但酿酒酵母系统也具有局限性，比如缺乏强有力的启动子，表达菌株不够稳定，分泌效率差，表达质粒易于丢失等[4]。所以，人们又发展了新一代的酵母表达系统——巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统，即甲醇酵母表达系统。

35

[5]近年来发现了一种甲醇型酵母即巴斯德毕赤酵母，其细胞的过氧化物酶系中含有甲醇代谢途径的必需酶，因而巴斯德毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中快速生长。目前使用最广泛的巴斯德毕赤酵母受体是由Cregg 1985年建立的GS115[6]。由于GS115具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因his4，因而可接受含HIS4的载体而具有HIS +表型以筛选转化子。现在大多利用甲醇为唯一碳源诱导巴斯德毕赤酵母表达系统进行外源蛋白的表达，然而基金项目：教育部高校博士学科专项科研基金（[1**********]）

作者简介：张建峰（1973-），男，副教授，作物生物技术

通信联系人：王丕武（1958-），男，教授，作物遗传育种及生物技术. E-mail: [email protected]

40 由于甲醇对表达产物的卫生安全性存在影响，因而需要开发不利用甲醇诱导的表达体系。

Waterham H R[7]等克隆的pGAP 组成型表达系统可以利用甘油或葡萄糖等无毒性物质作为唯一碳源，适于大规模生产外源蛋白，因此受到越来越多的关注。

然而，现阶段国内对于pGAP 组成型表达系统的研究才刚刚起步，对pGAP 系统还处在表面的认知上，对该系统在生产中的一些缺点也认识较少，导致研究进展缓慢。文中综合大45 量实际生产中的应用，介绍了pGAP 组成型表达系统存在的优缺点，为进一步的研究提供支

持。

1 毕赤酵母表达载体的比较

巴斯德毕赤酵母载体包括自主复制的游离载体和整合型载体，由于没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体。整合型载体导入酵母宿主细胞后通过50 同源重组与酵母细胞染色体基因组DNA 整合，能在酵母中稳定存在[8; 9]。现在应用于毕赤

酵母表达系统的载体有醇氧化酶1启动子表达载体(pAOX1)、三磷酸甘油醛脱氢酶启动子表达载体（pGAP ）、甲醛脱氢酶1启动子表达载体 (pFLD1)以及Invitrogene 公司开发的多种表达载体，如pPIC3、pPIC9、pPIC9k 、pAO804、pAO815、pPICz 系列和pPICza 系列等适合于胞内或分泌的表达载体[10]。

55 1.1 pAOX1表达载体

醇氧化酶1启动子(pAOX1)是最早开发的Pichia pastoris (P. pastoris ) 启动子。醇氧化酶是甲醇利用途径上的第一个酶，催化甲醇氧化为甲醛，在脱氢酶的进一步作用下为微生物提供碳源。AOX1基因的表达是受转录水平调控的。AOX1基因的调控是诱导机制和抑制机制相辅的过程，由于pAOX1启动子受到甲醇的强烈诱导，能非常有效的控制外源基因的表达60 [11-13]。在一般情况下，胞内AOX 酶的变化直接反映了外源蛋白的表达状况，因此通过分析

近年来，已经建立了pAOX1-P. pastoris表达系统的高密度发酵方法，并应用于一些重检测胞内AOX 酶的含量和变化速率，就可以确定外源基因所处的状态[14]。 组蛋白的生产[15]。但在生产中操作繁杂，需要更换碳源，延迟了发酵周期; 特别是甲醇有毒易于挥发，对表达产物的分离提出了要求，甲醇的大量应用也对环境造成污染，并存在一定65 的火灾隐患，制约了pAOX1表达系统在大规模工业化生产中的应用[8; 16; 17]。

1.2 pFLD1表达载体

1998年Shen 等报道了毕赤酵母中一个新的启动子，谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶基因启动子(pFLD1)， pFLD1不仅能以甲醇作为唯一的碳源，也能以烷化胺(例如无毒的物质甲胺) 作为唯一氮源诱导它所调控的下游基因的表达[18]。由于pFLD1 与pAOX1对于甲醇诱导表70 达的水平相当，因此pFLD1启动子扩大了毕赤酵母的应用范围，有较好的应用前景[19]。遗

憾的是，目前国内尚没有太多应用pFLD1启动子作为调控元件的表达载体的研究。

1.3 pGAP表达载体

pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是一种组成型强启动子，能和表达载体一起整合到酵母基因组中，随基因组一起复制和遗传，避免了外源基因的丢失现象[20]。 Waterham H R75 等首先成功地从P. pastoris基因组中克隆了pGAP [7]。

三磷酸甘油醛脱氢酶可以在包括巴斯德毕赤酵母在内的多种微生物中连续、高效的表达。近年来，编码三磷酸甘油醛脱氢酶蛋白的GAP 基因启动子已经被测定，并且证明了由于应用的碳源不同，其在巴斯德毕赤酵母中可以高水平表达重组蛋白的可行性。pGAP 启动

80 子的表达水平较AOX1启动子表达的水平高。 含有pGAP 启动子的质粒（pGAPz ）中具有不同于AOX1的筛选标记，不需要利用甲

醇的诱导而得到表达，pGAPz 质粒含有Zeocin TM 筛选标记，可以避免在筛选上甲醇存在的不利影响，Zeocin TM 抗性在酵母和大肠杆菌中均有生物活性。

2 pGAP-毕赤酵母表达系统概述

pGAP-毕赤酵母表达系统是最近几年来新发展起来的毕氏酵母表达系统。pGAPz 和85 pGAPza 是由美国Invitrogene 公司开发的专门针对于毕赤酵母的酵母表达载体，配套毕赤酵

母如GS115，X-33， KM71等。该表达系统在近些年已经陆续得到应用，并且成功的在P. pastoris 中表达出异源蛋白[21; 22]。由于该组成型启动子在发酵表达时可以利用甘油或葡萄糖等无毒性物质作为唯一碳源，不需要甲醇诱导，避免了在生产过程中大量甲醇利用所造成的污染及危险，并且表达产量高，发酵工艺简单，因此更加适于大规模生产[21]。

90 该系统的主要优点在于：首先是外源蛋白表达产量高; 其次是毕赤酵母自身分泌蛋白量

较少，利于后续的提取分离; 还有不需甲醇作为诱导剂，在发酵过程中，不需从一种碳源到另一种碳源的转换，既缩短了培养时间，又降低了培养过程中杂菌的污染概率。因此，pGAP 表达系统有望代替AOX1表达系统而应用于大规模外源蛋白的生产。

3 pGAP-毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的特性

95 3.1 pGAP系统调控的高效表达

近年来，已有报道一些外源蛋白在pGAP 系统的调控下得到高效表达。例如，田生礼等利用pGAP 系统表达碱性纤维素酶基因，以维持底物浓度的流加方式生产碱性纤维素酶，获得最高的菌体干重达29.8g/L，最高酶活性可达24U/mL[23]。随着越来越多的应用，更多的报道表明pGAP 系统调控表达的外源蛋白的产量高于pAOX1系统。Döring F 等报道在pGAP 100 启动子调控下P. pastoris表达的人肠肽转运载体( hPEPTl) 和功能载体蛋白(rPEPT2)的水平

比使用pAOX1均高5倍[24]。Delroisse JM等通过摇瓶发酵P. pastoris的结果表明：利用pGAP 启动子调控表达获得的重组蛋白的产量比用pAOX1启动子多两倍[25]。

3.2 pGAP表达系统的碳源调控简便

pGAP 表达系统受到碳源的强烈调控，不需要利用甲醇等有毒物质，而利用无毒的甘油105 或葡萄糖作为唯一碳源。并且，这三种物质利用于pGAP 系统的优异性还存在争议。 在

Waterham 等和张爱联等的研究结果中都证明以甲醇为碳源获得的表达产物最少[7; 26]，更多的研究倾向于利用甘油和葡萄糖作为pGAP 系统的碳源。在摇瓶发酵中，多以葡萄糖作为唯一的碳源。Döring F 等将携带pGAP-rPEPT2的P. pastoris细胞分别培养于含有葡萄糖和甲醇的培养基中，结果前者的rPEPT2表达水平较后者高大约8倍。甘油则较适合作为中大规110 模生物反应器中发酵P. pastoris生产重组蛋白的碳源[11]。

3.3 pGAP表达系统发酵周期短

与应用pAOX1比较，应用pGAP 系统的发酵周期明显较短。张爱联等分别利用pGAP 组成型表达系统和与pAOX1诱导型表达系统调控表达了angiostatin (AS)，并进行了比较，结果是组成型表达的峰值在第2d 出现，而诱导型表达的峰值则在第6d 才出现[26]。在pGAP 115 的调控下，外源蛋白随着细胞的增殖而分泌到培养基中，分泌过程中不需要由一种碳源转换

成另一种碳源，操作方便，在生产中发酵时间较pAOX1调控的系统短，有利于提高生产效率，降低生产成本。

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

3.4 pGAP表达系统更利于外源蛋白的提取

由于pAOX1表达系统在发酵过程中需要经甲醇诱导，再更换新的碳源进行分泌蛋白，120 在操作中比较繁琐，不适合于连续发酵[27]。pGAP 表达系统以甘油或葡萄糖进行发酵，不需

要更换碳源，更适于连续高密度发酵[28]。Goodrick 研究pGAP-P. pastoris组成型体系表达几丁质酶，发酵过程以葡萄糖为唯一碳源进行连续发酵，能持续发酵大约1个月时间，并且无

Khasa 等报道pGAP- P. pastoris表达系统能有效的表达人巨噬细酶蛋白降解现象的出现[21]。

胞集落刺激因子(hGM-CSF)[29]。以上研究表明pGAP 表达系统适于大规模、高密度连续的生125 产重组蛋白

4 展望

pGAP-毕赤酵母作为新一代的表达系统，可以利用无毒性的甘油或葡萄糖等物质作为唯一碳源应用于生产外源蛋白，表达产物量高，生产工艺简单，发酵周期短，能够进行连续高密度发酵，在大规模的生产中其突出的优异性正受到人们越来越多的关注。然而，该系统也130 存在一定的缺点。如：第一方面，pGAP 调控系统要利用强诱变剂Zeocin TM 进行筛选转化子，

可能导致转化子产生不可预料的突变，同时筛选标记Zeocin TM 的价格也比较昂贵; 第二方面，pGAP 启动子不能对外源基因的表达进行调控，仅适合表达对宿主无毒的蛋白，这就限制了一些酶利用该系统表达的可行性。所以，这些不足也为我们以后的研究提供了方向，鼓励我们不断克服在研究中遇到的困难。随着对pGAP-毕赤酵母表达系统研究的深入和优化，该135 系统将在生产外源蛋白领域中发挥重要的作用。

[参考文献] (References)

[1] 马兴元, 谭建华, 朱平，等. 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应用前景[J]. 中国兽医学报, 2003 (01): 98-101.

[2] Hitzeman RA, Hagie FE, Levine HL. et al. Expression of a human gene for interferon in yeast[J]. Nature, 1981,293: 717-722.

[3] 秦丽娜. 酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅰ基因的超表达[D]. 福州： 福建师范大学, 2008.

[4] 唐元家, 余柏松. 巴斯德毕赤酵母表达系统[J]. 国外医药(抗生素分册), 2002 (06): 246-250+271.

[5] 钮小松. 重组人胶原蛋白在巴氏毕赤酵母中分泌表达条件研究[D]. 南京：南京理工大学, 2008.

[6] Cregg J M, Barringer K J, Hessler A Y. et al. Pichia pastoris as a host system for transformations [J]. Mol. Cell. Biol, , 1985,5 (12): 3376~3385.

[7] Waterham H R, Digan M E, Koutz P J, et al. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter[J]. Gene, 1997,186 (1): 37-44.

[8] 丁镌, 宋跃芬, 袁野，等. 毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策[J]. 畜牧与兽医, 2007 (02): 57-59.

[9] 欧阳立明, 张惠展, 张嗣良，等. 巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展, 2000 (02): 151-154.

[10] Sears IB, J. O C, Rossanese O.W. et al. A versatile set of vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pastoris[J]. Yeast, 1998, 14 (8): 783-790.

[11] Cregg JM, Madden KR, Barringer KJ. et al. Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris [J]. Mol. Cell. Biol., 1989,9: 1316-1323.

[12] Koutz P, Davis G R, Stillman C, et al. Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes[J]. Yeast, 1989,5: 161-177.

[13] Romanos M. Advances in the use of Pichia pastoris for high-level gene expression[J]. Curr. Opin. Biotechnol., 1995,6 (5): 527-533.

[14] 顾小勇, 李强, 曹竹安. 毕赤酵母基因工程菌胞内aox 酶的检测方法[J]. 生物工程学报, 2001 (04): 474-477.

[15] 熊向华, 赵洪亮, 薛冲，等. 毕赤酵母醇氧化酶1启动子突变体的分离与鉴定[J]. 生物技术通讯, 2008 (01): 11-13.

[16] 潘英文, 张爱联, 张添元，等. Pichia pastoris表达系统的启动子研究进展[J]. 工业微生物, 2008 (06): 53-56.

[17] 李志龙, 张富春. 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 生物技术通报, 2006 (06): 9-13.

[18] Shen S, Sulter G, Jeffries T W, et al. A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of

140 145 150 155 160 165

中国科技论文在线

170 http://www.paper.edu.cn

175

180

185

190 foreign genes in the yeast Pichia pastoris[J]. Gene, 1998,216 (1): 93-102. [19] Sirajo U, 段慧明, 陈劲春. 毕赤酵母fld1启动子元件的克隆与测序[J]. 北京化工大学学报(自然科学版), 2007 (06): 634-636. [20] 隋少飞, 陈松林. 巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[J]. 生物技术通报, 2004 (03): 1-4. [21] Goodrick J C, Xu M, Finnegan R, et al. High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia pastoris expression system[J]. Biotechnol. Bioeng. , 2001,74: 492-497. [22] Zheng H, Wang X, Chen J, et al. Expression, purification, and immobilization of His-tagged D-amino acid oxidase of Trigonopsis variabilis in Pichia pastoris[J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006,70: 683-689. [23] 田生礼, 邵睿, 刘刚，等. 碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化[J]. 中国生物制品学杂志, 2009 (05): 425-430+437. [24] Döring F, Klapper M, Theis S, et al. Use of the Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase Promoter for Production of Functional Mammalian Membrane Transport Proteins in the Yeast Pichia pastoris[J]. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998,250 (2): 531-535. [25] Delroisse J-M, Dannau M, Gilsoul J-J, et al. Expression of a synthetic gene encoding a Tribolium castaneum carboxylesterase in Pichia pastoris[J]. Protein Expr. Purif., 2005,42 (2): 286-294. [26] Ai-Lian. Z, Jin-Xian. L, Tian-Yuan, Z. et al. Constitutive Expression of Human Angiostatin in Pichia pastoris Using the GAP Promoter[J]. Acta Genetica Sinica, 2004 (06): 552-557. [27] Inan M, Meagher M M. The effect of ethanol and acetate on protein expression in Pichia pastoris[J]. J. Biosci. Bioeng., 2001,92 (4): 337-341. [28] 周细南, 张爱联, 张添元，等. Pichia pastoris表达系统提高表达量的几个关键点[J]. 海南大学学报(自然科学版), 2008 (01): 68-73.

[29] Khasa Y P, Khushoo A, Srivastava L, et al. Kinetic studies of constitutive human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGMCSF) expression in continuous culture of Pichia pastoris[J]. Biotechnol. Lett., 2007,29: 1903-1908.