植物几丁质酶及其应用研究进展_张志忠

福建农林大学学报(自然科学版)

J o u r n a l o f F u j i a n A g r i c u l t u r e a n dF o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n )

第34卷第4期2005年12月

植物几丁质酶及其应用研究进展

张志忠, 吴菁华, 吕柳新, 林义章

(福建农林大学园艺学院, 福建福州350002)

摘要:几丁质酶是高等植物普遍存在的一种重要的病程相关蛋白, 近年来被广泛应用于植物抗病基因工程的研究. 本文概述了国内外有关植物几丁质酶的研究情况, 介绍了几丁质酶的特性、结构、分类、细胞学定位和功能及几丁质酶基因的克隆与其在植物基因工程中的应用.

关键词:几丁质酶; 转基因; 抗真菌基因工程中图分类号:Q556文献标识码:A

文章编号:1671-5470(2005) 04-0494-06

＊

P r o g r e s s o f p l a n t c h i t i n a s e a n di t s a p p l i c a t i o n

Z H A N GZ h i -z h o n g , W UJ i n g -h u a , L i u -x i n , L I NY i -z h a n g ǜL

(C o l l e g eo f H o r t i c u l t u r e , F u j i a n A g r i c u l t u r e a n dF o r e s t r y U n i v e r s i t y , F u z h o u , F u j i a n 350002, C h i n a )

A b s t r a c t :C h i t i n a s e i s a ni m p o r t a n t p a t h o g e n e s i s -r e l a t e d p r o t e i n , w h i c hu n i v e r s a l l y e x i s t s i n h i g h e r p l a n t s .S t u d i e s o np l a n t c h i t i -n a s e a r e b r i e f l y r e v i e w e d i n t h i s p a p e r , w h i c h i n c l u d e s t h e c h a r a c t e r i s t i c s , s t r u c t u r e , c l a s s i f i c a t i o n , c y t o l o g i c a l o r i e n t a t i o n a n d f u n c -t i o n s o f c h i t i n a s e a s w e l l a s c l o n i n g o f i t s g e n ea n d i t s a p p l i c a t i o n t o p l a n t g e n e e n g i n e e r i n g f o r d i s e a s e r e s i s t a n c e . K e yw o r d s :c h i t i n a s e ;t r a n s g e n e ; a n t i -f u n g a l g e n ee n g i n e e r i n g

几丁质酶(c h i t i n a s e ) 主要水解几丁质多聚体中β-1, 4糖苷键, 产生N -乙酰氨基葡萄糖寡聚体. 多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶. 高等植物本身不含作为真菌细胞壁组分之一的几丁质, 但当植物受到真菌、细菌和病毒等感染时, 几丁质酶的活性迅速提高. 因此, 普遍认为几丁质酶与植物对病原微生物的抗性有关, 是重要的病程相关蛋白. 本文主要对几丁质酶的结构、分类、特性、功能及其在植物抗病基因工程中的应用作一综述.

1　植物几丁质酶的结构和分类

典型的几丁质酶由N -端信号区、催化区和C-端延伸区组成, 有的还有几丁质结合域. 各功能域具

有各自的功能. N -端信号区由20多个氨基酸组成, 引导几丁质酶运输到内质网, 该区段与酶的抑菌活性有关; 催化区负责催化功能, 催化作用并不是抗真菌活性所必需, 估计可能参与干扰真菌菌丝的生长; 定位于

[1]

液泡的几丁质酶具有C -端延伸区, 该区是几丁质酶导向液泡所必需也是足够的信号. 缺乏C -端序列的几丁质酶基因转化烟草不会提高抗病性, 将烟草几丁质酶基因导入酿酒酵母中, 表达产生的几丁质酶有

[2]

94%存在于胞内(液泡中) , 切去C 端7个氨基酸的编码区, 转化后酶却分泌到培养基中.

[3][4]

对植物几丁质酶的分类已经过多次改进, S h i n s h i e t a l 提出几丁质酶可以归为三类, C o l l i n g e e t a l 在其基础上增设了第4类. Ⅰ类几丁质酶结构上包括3个功能区域, 即N -端区是几丁质结合区, C -端区是酶的催化区, 也是酶的主要功能区域, 二者通过一个多变的交联区连接在一起; Ⅱ类仅具有类似于Ⅰ类的酶催化区域, 而没有几丁质结合区和交联区; Ⅲ类与Ⅰ、Ⅱ类没有同源性; Ⅳ类类似于Ⅰ类, 但功能区较

[5][6]

小, 保守序列中有4处缺失, 其中仅有I a 型定位于液泡. 根据不断更新的研究资料, N e u h a u s e t a l 对上述分类系统进行了改进, 将几丁质酶细分为4个大组9个亚组. 相信随着研究的深入, 更加详细、合理的分类系统将会被提出, 这将有利于对该酶的合理有效利用.

2　植物几丁质酶的特性和功能

2. 1　植物几丁质酶的可诱导性

在正常情况下, 植物中几丁质酶活性较低, 经诱导后活性会迅速升高, 真菌、细菌、病毒等病原微生物

收稿日期:2004-11-28　　修回日期:2005-05-18基金项目:福建省自然科学基金资助项目(B 0510017) .

作者简介:张志忠(1976-) , 男, 博士, 讲师. 研究方向:植物生物技术. ＊通讯作者.

第4期张志忠等:植物几丁质酶及其应用研究进展

[7]

·495·

都可诱导几丁质酶的活性迅速上升. 此外, 大多数几丁质酶也可受某些非生物因素, 如机械损伤、乙烯、

[5][8]

紫外光等的诱导. 有的植物几丁质酶除具有几丁质酶活性, 还具有核糖体失活蛋白活性和蛋白酶抑

[9][10]

制剂活性等. 目前普遍认为植物体内不同类型几丁质酶的诱导存在着极其复杂的机理, 如S a l z e r e t a l 在苜蓿菌根形成过程中发现:病原侵染导致Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类几丁质酶基因被诱导了; 结瘤的形成也导致了同样种类酶的诱导表达, 但成瘤的早期Ⅰ、Ⅱ类几丁质酶基因被诱导, 而瘤成熟阶段Ⅳ类几丁质酶基因被诱导; 在菌根形成过程中上述3类几丁质酶基因的表达水平没有变化, 而一种Ⅲ类几丁质酶基因被强烈地诱导表达了, 但有另外2种Ⅲ类几丁质酶基因在上述所有过程中均未被诱导. 由此可见, 几丁质酶的诱导存在着极为复杂的机理, 对这方面的深入研究将为在不同的领域选用不同类型的几丁质酶提供依据. 2. 2　植物几丁质酶的功能

几丁质酶存在于各种植物中, 有广泛的功能, 对于不同类型几丁质酶的各种功能进行研究, 一方面可以加深对几丁质酶的了解、扩大其应用范围, 另一方面也使在具体应用过程中对不同类型的选择更具目的性. 下面对此加以介绍. 2. 2. 1　参与植物抗胁迫反应　现已证实几丁质酶是主要的植物病程相关蛋白之一, 不过大多数几丁质酶

[11]

也可受某些非生物因素的诱导, 这说明几丁质酶的诱导表达是植物对逆境的一般反应. H o n g e t a l 的研

[12]

究表明, 病原诱导几丁质酶表达过程中A B A 、Na C l 和干旱等因素也有着重要的作用. S c h n e i d e r e t a l 进

2+2+

一步发现, 病原和水杨酸诱导的几丁质酶活性上升与植物体内的C a 密切相关. C a 是植物体内重要的第二信使, 广泛地参与了植物逆境胁迫过程中的信息传导, 这一研究成为上述推断的有力佐证.

[13][4]

1986年S c h l u m b a u me t a l 首次报道了提纯的菜豆几丁质酶具抗真菌活性. 进一步研究表明, 提纯的烟草、马铃薯、黄瓜等多种植物几丁质酶对立枯丝核菌等20多种病原真菌和非病原真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用. 除抗真菌外, 几丁质酶对细菌、昆虫、螨等也表现出一定抗性. Ⅲ类几丁质酶大多兼具溶菌酶活性, 可分解细菌细胞壁的肽聚糖, 因而能对细菌产生毒害作用; 昆虫围食膜中含有几丁质物

[14]

质, 几丁质酶可作用于围食膜而影响昆虫的消化. D i n g e t a l 的研究表明, 转几丁质酶基因的植物叶片在

[15][16]

昆虫幼虫每日食物量中占2%即可导致幼虫的全部死亡. 几丁质酶也可对豇豆象鼻虫、蝴蝶幼虫等

[17, 18]

产生抑制或致死作用. 线虫的卵壳和螨类均含有几丁质物质, 几丁质酶对这两种病原物也起作用. 2. 2. 2　参与发育调控　很多资料表明, 植物几丁质酶的表达具有组织特异性, 参与了植物的发育调控. 目

[19]

前此类研究大多集中在几丁质酶与植物有性生殖过程的关系上. R o b i n s o n e t a l 的研究表明, Ⅳ类几丁质酶和葡萄的成熟密切相关, 并存在表达的组织或器官特异性; 而在胡萝卜中, 几丁质酶则参与了控制早

[20]

期胚胎的发育. 此外, 几丁质酶和植物营养生长也有密切的关系. 导入外源几丁质酶基因的植株生长更

[21]

加迅速. 从已有的资料来看, 几丁质酶参与植物生长发育调控, 可能在细胞分裂和分化以及在植物生长发育(如器官形成过程中) 的信号分子的产生中起作用, 其详细机制尚不清楚, 有待进一步研究.

[22]

2. 2. 3　其它生理功能　几丁质酶还具有其它多种生理功能. M i n i c e t a l 研究表明, 几丁质酶可以降解固氮菌产生的结瘤因子, 从而控制结瘤因子水平, 使植物与根瘤菌达到共生平衡, 参与共生固氮调控; S t a n -[23]g a r l i n e t a l 的研究表明, 几丁质酶广泛参与了植物光合作用等过程. 这些研究均暗示着几丁质酶具有多种生理功能, 可应用领域十分广泛.

综上所述, 植物几丁质酶的功能是十分广泛的, 但不同植物中的几丁质酶的功能是不尽相同的, 有的在抗病方面的作用明显, 有的则主要与发育有关. 几丁质酶在不同方面的作用可能是相关联的, 如前文所述几丁质酶参与共生固氮作用, 同时几丁质酶在植物发育的信号产生或传导中起作用, 而这两者可能具有相关性, 因为这都涉及到对信号分子的作用. 因此, 植物几丁质酶像许多其它植物防御蛋白一样, 不仅在植物抗病性方面具有十分重要的作用, 而且也有许多其它方面的作用, 存在着广泛的应用前景. 目前有关植物几丁质酶抗病作用的研究较多, 今后的研究中应加强几丁质酶表达调控的研究, 以阐明在植物发育与病程中的作用; 弄清几丁质酶诱导信号途径及其反应元件、酶结构与其功能的关系、各种几丁质酶的抑菌谱及其选择性抑菌机理等, 便于对其进行正确的选择利用, 这些研究将在很大程度上影响其实用意义.

3　几丁质酶基因的克隆

到目前为止在G e n e B a n k 中登录的几丁质酶基因核苷酸序列已有2778条, 其中已有256个几丁质酶基因被克隆, .

·496·

表1　部分已克隆的几丁质酶基因1)

T a b l e 1　So m e c h i t i n a s e g e n e s c l o n e d 基因名称

C h B 4w i n 6、g w i n 6C h i 26、C h i 33C h i t W 1R c h t 2S P 2A P 24C h i 14、C h i 17、C h i 9、C h i 3C h 3p L P 6C h i b 2、C h i b 1-1、C h i b 1-2P R O B 3C h i a 2-B 1c h i 1C h t B 1、C h t B 2、C h t B 3、C h t B 4A 1C h t -1、C h t -2、C h t -3W c h 1P z C h 1C h t A 2、C h t A 1V v C h i 4A 、V v C h i 4B C h i 2-1、C h i 2-2A . h . C h i 2-1、A . h . C h i 2-2R C 24I F 3B j C H I 1D A H 53P G R 99C h t B 、C h t C P G R 99-075A r -52C h i 3-P 1　　1) 资料来源于文献[24].

来源

福建农林大学学报(自然科学版) 第34卷

作者

R a s m u s s e n U

C l a r k eHR L e a h R E s a k a M K i mCY N i e l s e n KK M e l c h e r s LS D a n h a s hN A l l o n aI C h a n g S J W a t a n a b e A N a i r nCJ O h m e TM P o r a t R B e e r h u e s L V a dK N i s h i z a w a Y L i a oYC H e i t z T B e r g l u n d L B u c h t e r R R o b i n s o nSP H u d s p e t hRL K e l l m a n nJ W X u Y R e g a l a d oAP Z h a o KJ C h a n g M M K h a nAA A n c i l l oG C o l u c c i G R o j a s H R C h e n g CM

序列号

X 61488

U 01660、U 01661L 34210、L 34211D 49953L 40338、L 40336L 25826X 65700、X 65701Z 15138t o Z 15141X 95610U 31309A B 006748、A B 007126、A B 007127Z 70032A B 008892A F 090336U 02605t o U 02608X 63899、H 12697X 56787、D 16221t oD 16223X 76041X 78325X 79301U 49969、U 49970U 97521、U 97522Z 68152、Z 68153X 82329、X 82330X 87109Y 16415A F 098302L 37876A F 134347A F 043247、A F 043248A F 137070A F 125189A F 435026t o A F 435030

年份1992

[***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********]02

油菜白杨

大麦糊粉层有翼蚕豆水稻

尾孢菌侵染的甜菜烟草

感灰霉病番茄栗松树大豆甜橙烟草柑橘马铃薯豌豆水稻小麦

感病毒病烟草甜菜马铃薯葡萄棉花花生水稻

白羽扇豆芥菜豌豆草莓马铃薯豆薯咖啡辣椒

早期的研究认为不同植物几丁质酶基因的氨　表2　抗病性增强的部分转几丁质酶基因植物

a b l e 2　Ex a m p l e s o f p l a n t s t h a t s t r e n g t h e nd i s e a s er e s i s t a n c et h r o u g hi n t r o -基酸序列非常类似, 但在细菌、植物真菌和酵母中　Td u c i n gf o r e i g n c h i t i n a s e g e n e [25]

几丁质酶基因的核苷酸序列差异较大. L e v o r -[26]植物基因来源转化方法文献针对病害s o n e t a l 比较了在G e n e B a n k 中登录的从29种

番茄烟草农杆菌[27]枯萎病

植物中克隆的86种几丁质酶基因, 指出尽管在各烟草大麦农杆菌[28]菌核病

烟草农杆菌[29]菌核病类几丁质酶基因中存在一定的同源性, 但总的来油菜

杆状菌农杆菌[30]鞘斑病

讲这种同源性较低, 没有相对高度保守的核苷酸小麦

玫瑰水稻基因枪[31]黑斑病

序列. 这一结果表明, 利用其它植物的几丁质酶基黄瓜水稻农杆菌[32]灰霉病

木霉属农杆菌[33]黑斑病因的核苷酸序列作为探针和引物进行的克隆策略马铃薯

菊花水稻农杆菌[34]灰霉病

可能存在困难, 这可能是导致目前在植物抗病基日本稻水稻农杆菌[35]鞘斑病

大麦基因枪[36]白粉病因工程中可利用的几丁质酶基因来源狭窄的原小麦

苹果木霉属农杆菌[37]疮痂病

因. 烟草杆状病毒农杆菌[38]褐斑病

4　几丁质酶基因的转化

近年来利用导入外源几丁质酶基因增强植物抗病性的成功事例较多, 马铃薯、烟草、水稻、苹果等多种植物已获得了转几丁质酶基因的植株(表2) . 其中目的基因主要来源于植物, 如水稻、烟

水稻

花生大麦高粱水稻棉花竹籼水稻烟草水稻水稻大麦(未提及) 水稻P E G 和基因枪农杆菌农杆菌基因枪显微注射

激光微束穿刺基因枪[[[[[[[39]40]41]42, 43]44]45]46]条斑病叶斑病枯萎病茎腐病枯萎病黄萎病稻瘟病

第4期张志忠等:植物几丁质酶及其应用研究进展

·497·

草、菜豆等, 也有来源于昆虫和微生物; 转化方法以根癌农杆菌介导法为主; 转化植物产生的效果各种各

样, 一般转植物源几丁质酶基因对某些病原的抗性均有所增强, 且大多数转化植物增强的抗性与其所表达

[47]

的几丁质酶量呈正相关, 但也有一些例外. N i e l s e n e t a l 将甜菜几丁质酶基因转入烟草中, 尽管这种酶在甜菜中受病原诱导时迅速累积, 抗病品种远较敏感品种迅速且活性高, 但在烟草中表达该基因并不能增强

[48][49][50]

其抗病性, 在花椰菜、葡萄、胡萝卜和黄瓜等上也有类似的报道. 尽管目前几丁质酶基因的研究利

[50]

用取得了较大的进展, 但仍存在不少问题. P u n j a e t a l 指出, 尽管转几丁质酶基因可以增强植物的抗病性, 但这与物种、基因来源、类型、导入目标植株后在染色体上的定位及病原菌种类等均有关系, 上述种种不确定性导致利用导入外源抗病基因来增强植物对真菌性病害的抵抗能力的策略更加复杂.

5　利用外源几丁质酶基因增强植物抗病性中存在的主要问题和展望

多数病原菌对植物的侵染从细胞间隙开始, 主要是以体外寄生的方式摄取所需要的营养物质, 破坏植

[51]

物组织, 影响其生长. 因此, 为了使植株能抵抗真菌侵染, 抗真菌蛋白最好在胞间表达. K i s h i m o t o e t a l 指出, 转基因水稻中外源几丁质酶基因的高效表达和在胞间的定位是转基因水稻表现出较高抗病性的重要原因. 由于抗菌活性最高的Ⅰ类几丁质酶定位于液泡中, 为了使液泡中的几丁质酶从细胞中释放出来, 必

[52]

须对上述两种基因进行修饰. G r o v e r e t a l 认为, 如果移走该酶的液泡定位信号, 使其分泌到胞间, 可以更好地起抑菌作用, 他们利用两个终止子人为地使该信号失活, 将这种人工修饰的几丁质酶基因置于C a M V 35S 启动子的控制下并导入烟草, 成功地将经修饰的几丁质酶基因定位于胞间, 其生物学活性没有发生变化, 这一结果对几丁质酶基因在植物抗病基因工程中更为有效的利用有着重要的意义.

转入的目的基因的表达量是一个不容忽视的问题, 传统上认为表达量的高低和抗病性增强的程度密

[48]

切相关. 但M o r a e t a l 在花椰菜中发现, 尽管大多数转几丁质酶基因的植株表现出较对照高的几丁质酶

[50]

活性, 但并不能增强其抗病性. 这一问题可能和选用的基因来源有关, P u n j a e t a l 将矮牵牛、烟草和赤小豆的几丁质酶基因分别转入黄瓜中, 转化株对丝核菌、链酶菌和葡萄孢菌的抗性并未提高; 在以胡萝卜为材料的转化试验中发现, 对抵抗同样的病原菌, 烟草几丁质酶基因的效果大大优于矮牵牛几丁质酶基因.

[53][54]

此外, 外源几丁质酶基因的沉默及其在目标植物染色体上的定位等问题均与最终的转化结果有关, 这些不同的研究将有可能使目的基因实现定向导入, 并使其表达水平可调节, 最终使得转基因策略更加有效.

目前植物抗真菌基因工程研究取得了令人鼓舞的突破性进展, 采用基因工程手段改良植物抗病性的研究已进入一个振奋人心的时期, 相信随着遗传转化体系的改进、新的抗病基因的分离克隆、特异性或诱导型启动子的利用、为公众认可的可靠的环境安全风险性评价系统的建立等技术的不断完善; 随着对病原真菌致病分子机理和基因表达调控机理研究的深入, 植物抗真菌基因工程将在农业生产上得到更为广泛的应用. 参考文献:

[1]I S E L I B , B O L L E RT , N E U H A U S J M . T h e N -t e r m i n a l c y s t e i n e -r i c h d o m a i n o f t o b a c c o c l a s s I c h i t i n a s e i s e s s e n t i a l f o r c h i t i n

b i n d i n g b u t n o t f o r c a t a l y t i c o r a n t i f u n g a l a c t i v i t y [J ].P l a n t P h y s i o l o g y , 1993, 103(1) :221-226.

[2]V I E R H E I L I GH , A L THM , WI E M K E NA , e t a l . H y p h a l i n v i t r o g r o w t h o f t h e a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g u s G l o m u s m o s s e a e

i s a f f e c t e db y c h i t i n a s e b u t n o t b y b e t a -1, 3-g l u c a n a s e[J ]. My c o r r h i z a , 2001, 11(6) :279-282.

[3]S H I N S H I HU , N E U H A U SJ M , R Y A L S J , e t a l . S t r u c t u r e o f a t o b a c c o e n d o c h i t i n a s e g e n e :e v i d e n c e t h a t d i f f e r e n t c h i t i n a s e

g e n e s c a n a r i s e b y t r a n s p o s i t i o no f s e q u e n c e s e n c o d i n g a c y s t e i n s r i c hd o m a i n[J ]. P l a n t Mo l e c u l a r B i o l o g y , 1990, 26(4) :357-368.

[4]C O L L I N G EDB , K R A G HKM , M I K K E L S E NJ D , e t a l .P l a n t c h i t i n a s e s [J ]. T h e P l a n t J o u r n a l , 1993, 3(1) :31-40. [5]B O L L E RT , G E R I A , M A U C HF , e t a l . C h i t i n a s e i n b e a n l e a v e s :I n d u c t i o n b y e t h y l e n e , p u r i f i c a t i o n , p r o p e r t i e s , a n d p o s s i l -b l e f u n c t i o n[J ]. P l a n t a , 1983, 157(1) :22-27.

[6]N E U H A U SJ M , F R I T I GB , L I N T H O R S THJ , e t a l . Ar e v i s e dn o m e n c l a t u r e f o r c h i t i n a s e g e n e s [J ].P l a n t Mo l e c u l a r B i o l -o g yR e p o r t e r , 1996, 14(2) :102-104.

[7]吴乃虎. 基因工程原理(下册, 第2版) . 北京:科学出版社, 2001. 209.

[8], D N A L , A C K M A , t a l n t d e f e n y m e s w i t h c h i t i n a s n d s o m e i n v a -

·498·

福建农林大学学报(自然科学版) 第34卷

t i n ga c t i v i t i e s f r o m T r i c h o s a n t h s k i r i l o w i i c e l l c u l t u r e s [J ].P l a n t S c i e n c e , 1997, 158(2) :145-150.

[9]M A C H I N A N D I A R E N AM , C A S T I L L OM , O L I V I E R I F , e t a l . P r o t e a s e i n h i b i t o r a c t i v i t y i s a s s o c i a t e d t o a b a s i c c h i t i n a s e f r o m

p o t a t o b u t n o t t oa na c i d i c o n e [J ]. P o t a t oR e s e a r c h , 2001, 44(2) :187-195.

[10]S A L Z E RP , B O N A N O M I A , B E Y E RK , e t a l .D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o no f e i g h t c h i t i n a s eg e n e s i nM e d i c a g o t r u n c a t u l ar o o t s

d u r i n g m y c o r r h i z af o r m a t i o n , n o d u l a t i o n , a n dp a t h o g e ni n f e c t i o n[J ].Mo l e c u l a rP l a n t Mi c r o b eI n t e r a c t i o n s , 2000, 13(7) :763-777.

[11]H O N GJ K , H W A N GBK . I n d u c t i o n b y p a t h o g e n , s a l t a n dd r o u g h t o f a b a s i c c l a s s Ⅱc h i t i n a s e m R N Aa n d i t s i n s i t ul o c a l i -z a t i o n i n p e p p e r (C a p s i c u m a n n u u m )[J ]. P h y s i o l o g i aP l a n t a r u m , 2002, 114(4) :549-558.

2+

[12]S C H N E I D E RMS , K U R O S A K I F , N I S H I A . R o l e o f s a l i c y l i c a c i d a n d i n t r a c e l l u l a r C a i n t h e i n d u c t i o n o f c h i t i n a s e a c t i v i t y

i nc a r r o t s u s p e n s i o n c u l t u r e [J ]. P h y s i o l o g i c a l a n dMo l e c u l a r P l a n t P a t h o l o g y , 1994, 45(2) :101-109.

[13]S C H L U M B A U M A , M A U C HF .P l a n t c h i t i n a s e s a r e p o t e n t i n h i b i t o r s o f f u n g a l g r o w t h[J ]. N a t u r e , 1986, 324(4376) :365

-367.

[14]D I N GXF , G O P A L A K R I S H N A NB , J O H N S O NLB , e t a l . I n s e c t r e s i s t a n c e o f t r a n s g e n i c t o b a c c o e x p r e s s i n g a n i n s e c t c h i t i -n a s e g e n e [J ]. T r a n s g e n i c R e s e a r c h , 1998, 7(2) :77-84.

[15]G O M E S VM , O L I V E I R AAE , X A V I E RFJ . Ac h i t i n a s e a n d a b e t a -1, 3-g l u c a n a s e i s o l a t e d f r o mt h e s e e d s o f c o w p e a (V i g n a

u n g u i c u l a t aL .W a l p )i n h i b i t t h e g r o w t h o f f u n g i a n d i n s e c t p e s t s o f t h e s e e d [J ]. S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e , 1996, 72(1) :86-90.

[16]K R A M E RKJ , M U T H U K R I S H N A NS .I s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f a g e n o m i c c l o n e f o r t h e g e n e o f a n i n s e c t m o l t i n g e n -z y m e -c h i t i n a s e [J ]. I n s e c t B i o c h e m i s t r ya n dMo l e c u l a r B i o l o g y , 1997, 27(11) :87-90.

[17]Q I UJ , H A L L M A N NJ , K O K A L I S BN , e t a l . A c t i v i t y a n d d i f f e r e n t i a l i n d u c t i o n o f c h i t i n a s e i s o z y m e s i n s o y b e a n c u l t i v a r s r e -s i s t a n t o r s u s c e p t i b l e t o r o o t -k n o t n e m a t o d e s [J ].N e m a t o l o g y , 1997, 29(4) :523-530.

[18]肖炎农, 王明祖, 王道本. 淡紫拟青霉几丁质酶对南方根结线虫的影响[J ]. 中国生物防治, 1997, 13(1) :29-31. [19]R O B I N S O NS P , J A C O B SAK , D R YI B .A c l a s s Ⅳc h i t i n a s ei s h i g h l ye x p r e s s e di ng r a p eb e r r i e s d u r i n g r i p e n i n g[J ].

P l a n t P h y s i o l o g y , 1997, 114(3) :771-778.

[20]K R A G H KM , J A C O B S E N S , M I K K E L S E NJD .I n d u c t i o np u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f b a r l e yl e a f c h i t i n a s e [J ].

P l a n t S c i e n c e , 1996, 157(1) :55-68.

[21]P A T I LVR , WI D H O L MJ M . P o s s i b l e c o r r e l a t i o n b e t w e e n i n c r e a s e d v i g o u r a n d c h i t i n a s e a c t i v i t y e x p r e s s i o n i n t o b a c c o [J ].

C r o pS c i e n c e , 1994, 34(4) :1070-1073.

[22]M I N I CZ , B R O WNS , K O U C H K O V S K YY , e t a l .P u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l c h i t i n a s e -l y s o z y m e , o f a n o t h e r

c h i t i n a s e , b o t hh y d r o l y s i n g R h i z o b i u m m e l i l o t i n o df a c t o r s , a n do f ap a t h o g e n e s i s -r e l a t e dp r o t e i nf r o m M e d i c a g os a t i v ar o o t s [J ]. B i o c h e m i c a l J o u r n a l , 1998, 332(2) :329-335.

[23]S T A N G A R L I NJ R , P A S C H O L A T I SF .A c t i v i t i e so f r i b u l o s e -1, 5-b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e -o x y g e n a s e(r u b i s c o ) , c h l o r o -p h y l l a s e , b e t a -1, 3g l u c a n a s e a n dc h i t i n a s e a n dc h l o r o p h y l l c o n t e n t i n b e a nc u l t i v a r s (P h a s e o l u s v u l g a r i s )i n f e c t e dw i t hU r o -m y c e s a p p e n d i c u l a t u s [J ].P h y t o p a t h o l o g i c a , 2000, 26(1) :34-42.

[24]美国国家生物技术信息中心. G e n B a n k[E B /OL ].h t t p ://ww w . n c b i . n l m . n i h . g o v /we b /se a r c h /in d e x . h t m l /2000-08-15/2000-09-10.

[25]R A S M U S S E NU , B O J S E NK , C O L L I N G EDB . C l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a p a t h o g e n -i n d u c e d c h i t i n a s e i n B r a s s i c an a -p u s [J ].P l a n t Mo l e c u l a r B i o l o g y , 1992, 28(2) :277-287.

[26]L E V O R S O NJ , C H L A NCA . P l a n t c h i t i n a s e c o n s e n s u s s e q u e n c e s [J ]. P l a n t Mo l e c u l a r B i o l o g y R e p o r t e r , 1997, 15(2) :

122-133.

[27]L O G E M A N NJ , J A C HG , L O G E M A N NS , e t a l .E x p r e s s i o no f a r i b o s o m ei n h i b i t i n g p r o t e i n(R I P )o r a b a c t e r i a l c h i t i n a s e

l e a d s t o f u n g a l r e s i s t a n c e i n t r a n s g e n i c p l a n t s [A ].F R I T I G B , L E G R A N DM .Me c h a n i s m s o f P l a n t D e f e n s e R e s p o n s e s [M ].V e r l a g B e r l i nH e i d e l b e r g :S p r i n g e r , 1993. 446-448. [28]J A C H G , L O G E M A NS , W O L FG , e t a l . E x p r e s s i o n o f a b a c t e r i a l c h i t i n a s e l e a d s t o i m p r o v e d r e s i s t a n c e o f t r a n s g e n i c t o b a c -c o p l a n t s a g a i n s t f u n g a l i n f e c t i o n[J ].B i o l o g y P r a c t i c e , 1992, (1) :33-40. [29]G R I S O NR , G R E Z E SBB , S C H N E I D E RM , e t a l .F i e l d t o l e r a n c et o f u n g a l p a t h o g e n s o f B r a s s i c an a p u s c o n s t i t u t i v e l ye x -p r e s s i n g ac h i m e r i c c h i t i n a s e g e n e [J ]. N a t u r e B i o t e c h n o l o g y , 1996, 14(10) :643-646. [30]G H A R E Y A Z I EB , M E N G U I T OCA , R U B I ALG , e t a l . I n h e r i t a n c e o f e n h a n c e d r e s i s t a n c e t o s t r i p e d s t e mb o r e r i n t r a n s g e n -r O a t i v a L t a i n i n g a e C l b a r l e n a s eg e n e [J ]. C o n c e , , 30

第4期张志忠等:植物几丁质酶及其应用研究进展

·499·

[31][32][33][34]

[35][36][37]

[38][39][40][41][42][43][44]

[45][46]

[47]

[48][49][50][51]

[52][53][54]

(1) :21-27. M A R C H A N TR , D A V E YM R , L U C A SJ A , e t a l .E x p r e s s i o no f a c h i t i n a s e t r a n s g e n e i nr o s e(R o s ah y b r i d aL . )r e d u c e s d e v e l o p m e n t o f b l a c k s p o t d i s e a s e (D i p l o c a r p o n r o s a e Wo l f )[J ].Mo l e c u l a rB r e e d i n g , 1998, 4(3) :187-194. T A B E I Y , K I T A D ES , N I S H I Z A WAY , e t a l . T r a n s g e n i c c u c u m b e r p l a n t s h a r b o r i n g a r i c e c h i t i n a s e g e n ee x h i b i t e n h a n c e d r e s i s t a n c e t o g r a y m o l d(B o t r y t i s c i n e r e a )[J ]. P l a n t C e l l R e p o r t s , 1997, 17(3) :159-164. Z E I L I N G E RS , G A L H A U PC , P A Y E RK , e t a l .C h i t i n a s e g e n ee x p r e s s i o n d u r i n g m y c o p a r a s i t i c i n t e r a c t i o no f T r i c h o d e r m a h a r z i a n u mw i t hi t s h o s t [J ].F u n g a l G e n e t i c s a n dB i o l o g y , 1999, 26(2) :131-140. T A K A T S UY , N I S H I Z A WAY , H I B I T , e t a l .T r a n s g e n i c c h r y s a n t h e m u m[D e n d r a n t h e m a g r a n d i f l o r u m (R a m a t . )K i t a m u -r a ]e x p r e s s i n g a r i c e c h i t i n a s e g e n e s h o w s e n h a n c e dr e s i s t a n c e t o g r a y m o l d (B o t r y t i s c i n e r e a )[J ]. S c i e n t i a H o r t i c u l t u r a e , 1999, 82(2) :113-123. N I S H I Z A WAY , N I S H I OZ , N A K A Z O N OK , e t a l . E n h a n c e d r e s i s t a n c e t o b l a s t (M a g n a p o r t h e g r i s e a )i n t r a n s g e n i c j a p o n i -c a r i c e b y c o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o no f r i c e c h i t i n a s e [J ].T h e o r e t i c a l a n dA p p l i e dG e n e t i c s , 1999, 99(3) :383-390. B L I F F E L DM , M U N D YJ , P O T R Y K U S I , e t a l . G e n e t i c e n g i n e e r i n g o f w h e a t f o r i n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o p o w d e r y m i l d e wd i s -e a s e [J ]. T h e o r e t i c a l a n dA p p l i e dG e n e t i c s , 1999, 98(6) :1079-1086. B O L A RJ P , N O R E L L I J L , H A R M A NGE , e t a l . S y n e r g i s t i ca c t i v i t y o f e n d o c h i t i n a s e a n de x o c h i t i n a s e f r o m T r i c h o d e r m a a t r o v i r i d e (T . h a r z i a n u m )a g a i n s t t h ep a t h o g e n i c f u n g u s (V e n t u r i ai n a e q u a l i s )i nt r a n s g e n i ca p p l ep l a n t s [J ].T r a n s g e n i c R e s e a r c h , 2001, 10(6) :533-543. S H I J , T H O M A S CJ , K I N GLA , e t a l . T h e e x p r e s s i o n o f a b a c u l o v i r u s -d e r i v e d c h i t i n a s e g e n e i n c r e a s e dr e s i s t a n c e o f t o b a c -c o c u l t i v a r s t o b r o w n s p o t (A l t e r n a r i a a l t e r n a t a )[J ].A n n a l s A p p l i e dB i o l o g y , 2000, 136:1-8. D A T T AK , T UJ M , O L I V AN , e t a l . E n h a n c e dr e s i s t a n c e t o s h e a t h b l i g h t b y c o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o n o f i n f e c t i o n -r e l a t e dr i c e c h i t i n a s e i nt r a n s g e n i c e l i t e i n d i c a r i c ec u l t i v a r s [J ]. P l a n t S c i e n c e , 2001, 160(3) :405-414. R O H I N I VK , R A OKS .T r a n s f o r m a t i o no f p e a n u t (A r a c h i s h y p o g a e aL . )w i t h t o b a c c o c h i t i n a s e g e n e :va r i a b l e r e s p o n s e o f t r a n s f o r m a n t s t o l e a f s p o t d i s e a s e [J ]. P l a n t S c i e n c e , 2001, 160(5) :889-898. B L I F F E L DM , M U N D YJ , P O T R Y K U S I , e t a l . G e n e t i c e n g i n e e r i n g o f w h e a t f o r i n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o p o w d e r y m i l d e wd i s -e a s e [J ]. T h e o r e t i c a l a n dA p p l i e dG e n e t i c s , 1999, 98(6) :1079-1086. Z H UH , M U T H U K R I S H A N AS , K R I S H N A V E N I S , e t a l .B i o l i s t i ct r a n s f o r m a t i o no f s o r g h u m u s i n gar i c ec h i t i n a s eg e n e [J ]. G e n e t i c s a n dB r e e d i n g , 1998, 52(2) :243-252. K R I S H N A V E N I S , J E O U N GJ M , M U T H U K R I S H N A NS , e t a l . T r a n s g e n i cs o r g h u mp l a n t s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s i n g ar i c e c h i t i n a s e g e n e s h o wi m p r o v e dr e s i s t a n c e t o s t a l k r o t [J ].G e n e t i c s a n dB r e e d i n g , 2001, 55(2) :151-158. G H A R E Y A Z I EB , M E N G U I T OC , R U B I ALG , e t a l .I n s e c t -r e s i s t a n t t r a n s g e n i c a r o m a t i c r i c e e x p r e s s e s ab a r l e yc h i t i n a s e g e n e a n d i s r e s i s t a n t a g a i n s t s h e a t hb l i g h t [A ]. I n t e r n a t i o n a l R i c e R e s e a r c h I n s t i t u t e . R i c e R e s e a r c h f o r F o o dS e c u r i t y a n d P o v e r t yA l l e v i a t i o n[C ].P h i l i p p i n e s :In t e r n a t i o n a l R i c e R e s e a r c h I n s t i t u t e , 2001. 345-352. 刘桂珍, 蓝海燕, 田颖川, 等. 利用激光微束穿刺法获得抗黄萎病转基因棉花的研究[J ]. 中国激光, 2000, 27(3) :279-283.

左清凡, 张建中, 袁红旭, 等. 抗稻瘟病转基因水稻竹转68的选育[J ]. 杂交水稻, 2001, 16(1) :10-11. N I E L S E NKK , M I K K E L S E NJ D , K R A G H KM , e t a l . A n a c i d i c c l a s s Ⅲc h i t i n a s e i ns u g a r b e e t :i n d u c t i o nb y C e r c o s p o r a b e t i c o l a , c h a r a c t e r i z a t i o n , a n de x p r e s s i o ni n t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s [J ]. Mo l e c u l a r P l a n t Mi c r o b e I n t e r a c t i o n s , 1993, 6(4) :495-506. M O R AA , E A R L EED . T r a n s f o r m a t i o n o f b r o c c o l i w i t h a T r i c h o d e r m ah a r z i a n u me n d o c h i t i n a s e g e n e [J ].C r u c i f e r a e N e -w s l e t t e r , 1999, 21:57-58. K I K K E R TJ R , A L I GS , WA L L A C EPG , e t a l . E x p r e s s i o n o f a f u n g a l c h i t i n a s e i nV i t i s v i n i f e r aL . `M e r l o t ' a n d `C h a r -d o n n a y ' p l a n t s p r o d u c e d b y b i o l i s t i c t r a n s f o r m a t i o n [J ].A c t aH o r t i c u l t u r a e , 2000, 528:297-303. P U N J AZK , R A H A R J OS H . R e s p o n s e o f t r a n s g e n i c c u c u m b e r a n d c a r r o t p l a n t s e x p r e s s i n g d i f f e r e n t c h i t i n a s e e n z y m e s t o i n -o c u l a t i o nw i t h f u n g a l p a t h o g e n s [J ]. P l a n t D i s e a s e , 1996, 8(9) :999-1005. K I S H I M O T OK , N I S H I Z A WAY , T A B E I Y , e t a l .D e t a i l e da n a l y s i s o f r i c e c h i t i n a s e g e n e e x p r e s s i o n i nt r a n s g e n i c c u c u m b e r p l a n t s s h o w i n g d i f f e r e n t l e v e l s o f d i s e a s e r e s i s t a n c e t o g r a y m o l d (B o t r y t i s c i n e r e a )[J ]. P l a n t S c i e n c e , 2002, 162(5) :655-662. G R O V E RA , Y A S H P AL , A R N A BS , e t a l . R e m o v a l o f v a c u o l a r t a r g e t i n g s i g n a l f r o mc l a s s Ⅰv a c u o l a r c h i t i n a s e l e a d s t o i t s e x t r a c e l l u l a r s e c r e t i o n i n t r a n s g e n i c t o b a c c o [J ]. P l a n t B i o c h e mi s t r ya n dB i o t e c h n o l o g y , 2001, 10(2) :139-142. K U N ZC , S C H O BH , L E U B N E RM G , e t a l . B e t a -1, 3-g l u c a n a s e a n d c h i t i n a s e t r a n s g e n e s i n h y b r i d s s h o wd i s t i n c t i v e a n d i n -d e p e n d e n t p a t t e r n s o f p o s t t r a n s c r i p t i o n a l g e n es i l e n c i n g [J ].P l a n t a , 2001, 212(2) :243-249. C H E NL , G A R R E T TTP , F I N C H E RGB , e t a l . At e t r a do f i o n i z a b l e a m i n o a c i d s i s i m p o r t a n t f o r c a t a l y s i s i nb a r l e y b e t a -g l u c a n a s e s [J ]. B i o l o g i c a l C h e m i s t r y , 1995, 270(14) :8093-8101.