涂布平板法

涂布平板法

实验器材

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制

牛肉膏 0.3g

蛋白胨 1g

氯化钠 0.5g

琼脂 2g

自来水 100mL

pH 7.0～7.2

灭菌 1.05kg/cm2，22min

配制具体步骤

1．称量

按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

2．溶化

在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。

3．调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。

4．过滤

趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。很多都是不需要过滤的。

5．分装

按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图Ⅴ-1。

分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。

(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

6．加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。

7．包扎

加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8．灭菌

将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9．搁置斜面

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

10．无菌检查

将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。

2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）

3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。

四、实验方法

1．样品稀释液的制备 准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。

图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养

用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。

2．平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。

（1）混合平板培养法 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。

（2）涂抹平板计数法 涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。

回答人的补充 2009-11-09 23:10

三、实验器材

1．活材料：你的材料

2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）

3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。

提问人的追问 2009-11-10 17:16

还有关于高氏一号、马丁氏的吗？求解..万分感谢

回答人的补充 2009-11-10 18:17

高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。这种培养基是由可溶性淀粉（作为碳源），KNO3（作为氮源），NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O（作为无机盐，为微生物提供钠、钾、磷、镁、硫等离子）和FeSO4· 7H2O（作为微生物的微量元素，提供铁离子）等组成。由于磷酸盐和镁盐相混合时产生沉淀，因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分。对于象FeSO4·7H2O这样的微量成分，则可预先配成高浓度的贮备液，在配制培养基时按需要加入一定的量。

高氏1号培养基配方如下：

可溶性淀粉 20g

NaCl 0．5g

KNO3 1g

K2HPO4·3H2O 0．5g

MgSO4· 7H2O 0．5g

FeSO4·7H2O 0．01g

琼脂 15—20g

水 1000ml

pH 7．4—7．6

三、器材

可溶性淀粉，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O， FeSO4·7H2O，琼脂， 1mol/L NaOH， 1mol/ LHCl；

试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5．5—9．0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布

等。

四、操作步骤

1．称量和溶化

按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4·7H2O配成0．01g/ml，再在1000ml培养基中加入1ml的0．01g/ml的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Bengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。

马丁氏培养基配方如下：

KH2PO4 1g

MgSO4·7H2O 0．5g

蛋白胨 5g

葡萄糖 10g

琼脂 15－20g

用蒸馏水定容至1000ml

此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3．3ml。

由于链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基溶化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液，在100ml培养基中加1%链霉素液0．3ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。

后面的步骤都是差不多的。像这些培养微生物的方法，只是在培养基的培制上有一点区别，其它方面都是差不多的。