植物抗病反应中的蛋白磷酸化

山东科学第14卷　第2期V o l 114　N o 12　　　　　　　　　　　　　　　　　2001年6月Jun 12001SHANDON G SC IEN CE

文章编号:100224026(2001) [1**********]综述3

植物抗病反应中的蛋白磷酸化

杨合同1, 王加宁2, 徐砚珂2, 肖斌3, 唐文华4

(11山东省科学院中日友好生物技术研究中心, 山东济南250014; 21山东省

科学院生物研究所, 山东济南250014; 31山东省农药检定所, 山东济南

250100; 41中国农业大学植物病理系, 北京100094)

摘要:在植物抗病反应中, 发现有蛋白磷酸化现象发生, 已经证明的有关因子包括M BP 蛋白激酶、大雄疫霉激发子、丁香霉素、pp 29和pp 51蛋白激酶以及双链RNA 。蛋白磷酸化是细胞信号传递系统的组成部分, 与植物抗病反应有关的蛋白磷酸化研究将会发现新的植物病害防治途径。

关　键　词:抗病; 蛋白质; 磷酸化; 激酶

中图分类号:　S 43212+3　　　　文献标识码:A

蛋白质磷酸化是细胞信号传递系统的组成部分, 在许多生命活动中扮演重要角色, 如基因与代谢活动的调节, 细胞分化, 肿瘤形成, 细胞周期现象, 由生长因子和激素激发的信号传递等。在动物中, 多数胞外信号的受体为蛋白激酶。在植物中, 已知蛋白磷酸化与光刺激, 植物生长激素和热刺激有关。近来的研究结果表明, 蛋白磷酸化和蛋白激酶参与植物保卫反应的启动。植物病原菌产生的植物毒素, 致病过程和蛋白酶抑制因子等均可诱发植物蛋白质的磷酸化反应。同动物相比, 植物的信号传递系统研究尚未形成完整的体系, 许多研究结果借鉴了动物的研究资料。植物病害系统中的蛋白磷酸化研究更少, 从发表的资料来看, 多数仅是发现有蛋白磷酸化参与其中, 而其细节和生物学意义并不清楚。本文拟先简单介绍动物和植物信号传递系统的异同, 再介绍与蛋白磷酸化有直接关系的蛋白激酶, 然后从与病害系统相关的研究结果, 介绍植物抗病反应中蛋白磷酸化的研究概况, 以期总结植物抗病反应中的蛋白磷酸化研究结果, 利用这些结果开展进一步研究, 进而发现新的病害防治途径。蛋白磷酸化的逆反应是去磷酸化, 对于保持磷酸化信号的平衡十分重要, 本文也介绍一下与植物去磷酸化有关的磷酸酯酶情况。

收稿日期:2001202206

作者简介:杨合同(19662) , 男, 山东高唐人, 博士后, 从事植物病害生物防治研究工作。

1　动物与植物信号传递系统的异同

详见图1。由图1[1]可知, 植物与动物的信号传递系统具有一定的相似性, 但也有区别。如图所示, 在植物中的钙依赖型蛋白激酶(CD PK ) 在动物中就没有, 反过来, 在动物中以c AM P 为基础的信号传递途径(如PKA ) 以及PKC , 在植物中也没有确切发现。除这些重要区别之外, 与蛋白磷酸化有关的几种蛋白激酶则有共同之处, 如都有钙 钙调蛋白依赖型蛋白激酶和跨膜的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶, 1995年还发现酪氨酸蛋白激酶也参与植物信号的传递[1]。

2　蛋白激酶

蛋白激酶是一类磷酰基

转移酶, 能将A T P (少数情况

下为GT P ) 的末端磷酰基转

移到底物蛋白, 在特异的氨

基酸残基上发生磷酸化反

应, 从而导致酶蛋白的构象

改变, 酶的活性也随之变化。

所以蛋白激酶都有高度保守

的氨基酸序列, 这些保守序

列在酶与A T P 相结合以及图1　已知植物和动物跨膜信号传递组份单元间的异同发生底物磷酸化反应时不可缺少。根据氨基酸结合的特异性, 蛋白激酶可大体上分为两类:酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶。酪氨酸蛋白激酶又分为两种, 一种是类似生长因子受体的受体酪氨酸蛋白激酶(R T K ) , 另一种是细胞质或细胞核酪氨酸蛋白激酶。丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶大多数为细胞质蛋白质, 很可能是细胞外信号与生理活动变化之间的信号桥梁, 通常依据它们不同的调节方式来分类, 一般有:①第二信使依赖型蛋白激酶, 如PKA (蛋白激酶A ) 为c AM P 依赖型蛋白激酶, 当与c AM P 结合后, 才显示酶

钙调蛋白依赖型活性; ②蛋白激酶C (PKC ) , 需要有钙和磷脂等的存在才有酶活性; ③钙

蛋白激酶(Ca 2+) ; ④自身磷酸化状态不同的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶[2]。

PKA 和PKC 是动物中了解最多的蛋白激酶。PKC 有3个大类, 共10种, 每种不同的PKC 对不同激活因子的反应不同, 这些激活因子包括二酯酰甘油(DA G ) , Ca 2+, 磷酯酰丝氨酸, 溶血卵磷酯和顺式不饱和脂肪酸等。PKC 不一定需要DA G 和Ca 2+, 但均需要磷酯酰丝氨酸。有限度的蛋白质水解作用也可激活PKC , 使PKC 转变成非Ca 2+依赖型。

PKA 有两个活性亚基, 当调节亚基与c AM P 结合后脱离, 催化亚基即被激活, PKA 因催化亚基的差异而有复杂的表现。

迄今为止, 在植物中尚未确证KPA 或PKC 的存在, 已发现的蛋白激酶主要有:①跨膜蛋白激酶(T ran s m em b rane K inases ) , 属于丝氨酸 苏氨酸类; ②钙依赖型蛋白激酶(CD PK ) , 为植物和原生生物特有, 在动物中尚未发现, 主要特点是结构中有一个N 末端

激酶催化区域, 该区域和C 末端类似钙调蛋白的Ca 2+结合区域相邻接; ③钙 钙调蛋白依

2+赖型蛋白激酶(Ca 2+ CAM 依赖型蛋白激酶) 。CD PK 和Ca CAM 依赖型蛋白激酶是植

物体中以Ca 2+为基础的两种基本蛋白磷酸化途径; ④M A P 蛋白激酶, 也称为分裂素激活蛋白, 是一种受胞外信号调节的激酶, 控制细胞的增殖过程[1]。

3　蛋白磷酸酯酶

同蛋白激酶相比, 有关蛋白磷酸酯酶的研究很少, 与其重要性不相匹配。蛋白质的磷酸化状态是磷酸化与去磷酸化, 即蛋白激酶活性和磷酸酯酶活性间动态平衡的表现, 去磷酸化同样可以调节酶的活性, 如菠菜中的蔗糖磷酸合成酶可以通过去磷酸化得到活化。在哺乳动物中, 已发现了四类磷酸酯酶。磷酸酯酶的分类依据是它们对不同抑制剂和离子的反应。植物中已发现了三类磷酸酯酶, 即1型磷酸酯酶(T yp e ) , 在豌豆、胡萝卜、B rassi 2

另两种蛋白ca oleracea 和玉米中均有报道, 其中B . oleracea 和玉米的磷酸酯酶已被克隆。

磷酸酯酶是2A 和2C 型, 发现于胡萝卜, 豌豆和小麦。 型和2A 型磷酸酯酶对抑制剂冈田酸(okadaic acid ) 很敏感, 目前试图通过研究这类抑制剂的作用将磷酸酯酶的活性与各种细胞功能和生理活动联系起来[1, 3]。

4　植物抗病反应中的蛋白质磷酸化现象

411　M B P 蛋白激酶

该激酶可能是M A P 激酶的一种。M A P 蛋白激酶, 即分裂素激活的蛋白激酶, 受胞外信号调节, 是动物、酵母菌信号传递途径的重要中间环节。其分子量在40～50KD 之间, 由上游蛋白激酶在其苏氨酸和酪氨酸残基上发生磷酸化而进行调控, 这是M A P 激酶的主要特点。W ilson 曾于1993年报道了烟草细胞液体培养物中有M A P 激酶类似物存在[4]。

M B P 蛋白激酶(髓磷脂碱性蛋白, m yelin basic p ro tein ) 由Suzuk i 于1995年在真菌激发子诱导的烟草细胞流体培养物中发现[5]。用来自P hy top h thora inf estans 细胞壁的激发子处理烟草细胞的液体培养物, 可以激活保卫基因的转录, 这种激活反应可被星孢素(stau ro spo rine ) 和钆(Gd 3+) 离子所消除。星孢素是蛋白激酶抑制剂, 故认为在激发子信号向下传递的过程中, 蛋白磷酸化具有重要作用。Gd 3+是Ca 2+离子通道抑制剂, 所以推测Ca 2+也参与信号的传递, 或参考信号传递的调控。激发子处理的烟草中可检测到47KD 蛋白激酶, 在激发子处理后很快就产生, 且维持时间较短。该激酶可在丝氨酸或苏氨酸残基上使M B P 发生磷酸化。星孢素和Gd 3+能抑制47-KD 蛋白激酶的诱导激活, 星孢素同时也抑制该激酶本身的活性。蛋白合成抑制剂放线菌酮存在时, 激发子诱导的M B P 激酶活性持续时间较长, 磷酸酯酶1和2A 的抑制剂Calycu liu A 存在时也有同样的效应, 说明M B P 蛋白激酶的激活不需要合成新的蛋白质分子, 而且磷酸酯酶也同时参与了M B P 激酶的调节。用磷酸化酪氨酸特异性抗体进行免疫点杂交和免疫沉淀检测, 在激发子诱导的烟草细胞中发现了在酪氨酸残基上发生了磷酸化的47-KD M B P 激酶, 说明M B P 激酶是烟草细胞中激发子信号传递途径中的一个环节, 而且它本身的活性是通过酪氨酸残基

的磷酸化反应来调节的。

由于以下特性为47KD M B P 激酶与M A P 激酶所共有, 推测前者可能是后者的一种:①在离体条件下, 均能使M B P 发生磷酸化, 但不使酪蛋白和组蛋白发生磷酸化; ②活性调控均通过上游蛋白激酶在酪氨酸残基上发生磷酸化进行; ③分子量均在40～50KD 之间; ④均受胞外激发信号的调节。47KD M B P 激酶在细胞信号传递中的可能作用如图2所示[4]。

412　大雄疫霉激发子与蛋白磷酸

化

欧芹(Parsley , P etroselinum

crisp um ) 是大豆病原菌大雄疫霉菌

(P hy top h thora m eg asp er m a f . sp .

g ly cinea ) 的非寄主植物, 后者侵染

欧芹时可产生过敏性坏死反应, 围

绕侵染点形成小区域性坏死斑点,

为典型的植物保卫反应。这种反应

的发生包括p henylp rop ano id 途径

的转录启动, 植物保卫素喃喃香豆图2　烟草细胞中47KD 激酶的激发子座对反应建议模型素的产生, 束缚于细胞壁的酚类物

质的产生, 以及PR 蛋白的合成。用来自P . m eg asp er m a 细胞壁的激发子处理欧芹液体培养的细胞, 同样可以诱导上述保卫反应; 同时还观测到有几种蛋白质发生快速、短时和有序的磷酸化反应。这种磷酸化反应可因激发子的消除而消失, 为激发子特异性反应, 不能用其它方法, 如热、紫外照射和氯化汞等诱导产生。激发子用链霉蛋白酶处理后, 也失去了诱导磷酸化反应的能力。该激发子还能诱导出苯丙氨酸氨裂解酶和4-香豆酸:CoA 连接酶m RNA , 并使之保持2h , 表示激发子诱导的磷酸化反应与基因的转录启动过程有一定关系。某些蛋白的磷酸化发生在诱导处理的早期, 如中性蛋白质45KD 蛋白, 它存在于微体和细胞质中, 其磷酸化反应在激发子处理后1m in 即可发生。另外, 激发子诱导蛋白磷酸化时依赖于Ca 2+离子的参与。这些结果说明, 欧芹细胞接受到外源信号之后, 蛋白质的磷酸化参与了信号传递[6]。

413　丁香霉素与蛋白磷酸化

丁香霉素(Syringom ycin ) 是一种肽毒素, 为P seud o m onas sy ring ae p v . sy ring ae 的毒性因子, 可以激发红甜菜贮藏组织全膜多肽的磷酸化, 其中的一种是分子量为100KD , 大小与质子泵A T P 酶相似的多肽。该多肽的磷酸化反应对羟胺不敏感, 表明该多肽的磷酸化是由激酶引起的典型磷酸化反应。丁香霉素可以激发植物A T P 酶的活性(但不影响A T P 酶本身的活性) , 该激发反应可被脱氧胆酸钠所抑制, 脱氧胆酸钠也同时显著降低了所有膜多肽的磷酸化程度, 而100KD 多肽则几乎不能发生磷酸化。随丁香霉素处理剂量的增大, 质膜A T P 酶所受的激发程度随之增加, 相反地, 100KD 多肽磷酸化程度也上升,

且对羟胺不敏感, 这两者的活性随丁香霉素剂量变化的动态曲线十分吻合, 在丁香霉素达10～20ug mL 时, 100KD 多肽的磷酸化程度达到高峰。这表示100KD 多肽与A T P 酶有密切关系, 有可能二者为同一种物质。另外, 多肽磷酸化反应与Ca 2+离子有关, 加入Ca 2+离子螯合剂ED TA , 多肽的磷酸化或者被降低, 或者不发生, 如果再加入过量的Ca 2+, 则多肽的磷酸化反应可以恢复。由此推论丁香霉素可以调节某种原有的蛋白激酶, 蛋白激酶使某些多肽, 包括100KD 多肽(可能是A T P 酶) , 发生磷酸化[7]。

414　pp 29和pp 51蛋白激酶

～4片叶用TM V 接种后, 上部叶片即产生了对TM V 和蓝N -基因型烟草最下部3

霉病的抗性。在非接种叶片上, 可观察到两种蛋白质(pp 29和pp 51) 被磷酸化。磷酸化的pp 51是一种可溶性细胞质蛋白, 而pp 29则束缚于质膜上。磷酸化氨基酸残基分析表明, 质膜蛋白是在丝氨酸残基上被磷酸化, 而不是在酪氨酸残基上发生磷酸化。Ca 2+可促进pp 29的磷酸化程度, 而水杨酸则对蛋白磷酸化没有影响。因此推测pp 51和pp 29是由丝氨酸 苏氨酸蛋白磷酸化反应。该蛋白的磷酸化反应对丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶的抑制剂星孢素和H -7高度敏感, 而对酪氨酸蛋白抑制剂染料木黄酮(gen istein ) 不敏感, 也有受磷酸酯酶抑制剂冈田酸的影响; 在体外, 向样品中直接加入A T P (Α-32P ) , 也未发现pp 29能结合A T P 。这些证据说明pp 51和pp 29de 磷酸化是在蛋白激酶的参与下实现的。植物中的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶一般位于细胞膜上, pp 29蛋白也是在细胞膜上, 所以推测pp 29是信号的受体, 而其磷酸化则可能是信号传递的一种方式。TM V 接种诱导pp 29磷酸化可能具有如下意义:①磷酸化的蛋白是配体激活的蛋白激酶; ②磷酸化的激酶结合信号之后, 成为后续蛋白激酶的底物; ③信号激活一种蛋白激酶, 该酶反过来又使膜蛋白发生磷酸化。但pp 29不可能是pp 51磷酸化的相关激酶, 因为去除提取物中的膜蛋白(含

[8]pp 29) 并不影响pp 51的磷酸化。

415　双链RNA (ds -RNA ) 与蛋白磷酸化

1988年, C rum 等用TM V 接种烟草, 在烟草中发现了一种分子量为68KD 的蛋白质发生了磷酸化反应[9]。在不接种TM V 的对照中, p 68也以磷酸化状态存在, 但比TM V 处理的烟草少3倍。如果向未接种TM V 的烟草匀浆中加入ds 2RNA , 可明显提高磷酸化p 68蛋白的含量。还发现p 68中有一个A T P 结合位点, 并且有蛋白激酶的活性。推测p 68是一种可自身磷酸化的ds -RNA 依赖型蛋白激酶, 在蛋白质合成以及侵染细胞中病毒的增殖调控方面有重要作用[9]。

5　结　语

植物抗病反应中发生蛋白质磷酸化已经是不争的事实, 但是有关的研究还停留在现象的观察阶段, 对于蛋白质磷酸化发生的详细步骤及其在抗病反应中的生物学意义还没有系统深入的研究。但是, 蛋白质的磷酸化是细胞信号传递系统的重要组成部分, 是联系病原物侵染和植物抗病机制的重要环节。深入而系统的研究将会发现新的植物病害防治途径。

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Prote i n phosphoryla tion i n d isea se resistance respon se of plan t

12234YAN G H e 2tong , W AN G J ia 2n ing , XU Yan 2ke , X I AO B in , TAN G W en 2hua

(1. B iotechnology R esea rch Cen ter , S hand ong A cad e m y of S cience , J inan 250014, Ch ina ; 2. B iology R esea rch Institu te , S hand ong A cad e m y of S cience , J inan 250014, Ch ina ; 3. Institu te f or Con trol of A g roche m ica ls , S hand ong P rov ince , J inan 250100, Ch ina ; 4. D ep t . P lan t P a thology , Ch ina A g ricu ltu ra l U n iversity , B eij ing 100094, Ch ina )

Abstract :P ro tein p ho sp ho rylati on w as found in the p rocess of p lan t resistan t respon se

. It w as found that M B P k inase , P hy top h thora m eg asp er m a elicito r , sy 2tow ard p athogen s

ringom ycin , pp 29and pp 51k inases and doub le strand RNA (ds 2RNA ) w ere related to the p ho sp ho rylati on even ts . P ro tein p ho sp ho rylati on is a con stituen t of the cell signal tran s 2ducti on chain , the ex ten sive research w ill lead to estab lishm en t of new m ethods fo r p lan t diseases m anagem en t .

Key words :disease resistance ; p ro tein ; p ho sp ho rylati on ; k inase