PH1462 PhyGet细菌膜蛋白提取试剂盒实验手册
PH1462|PhyGetBacterial Membrane Protein Isolation Kit
Catalog No :PH1462Size :☐50T Storage :Store@4℃
简介
本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细胞后,通过超速离心分离出细胞膜和附着的蛋白质。跟传统的密度梯度离心法和去污剂法相比,本方法具有下列特点:
1. 一步式分离细胞膜和膜蛋白,密度梯度离心法简单快捷。
2. 膜蛋白纯度高,能够去除各种胞浆蛋白的污染,也能去除松散附着在细胞膜上的蛋白,所得膜蛋白主要是整合蛋白。
3. 膜蛋白完整性好,主要是由于实际中有抑制蛋白酶成分。
4. 回收效率高,一般能得到相当于总蛋白量6%的膜蛋白。
5. 可用于E. coli ,S. typhimurium ,K. aerogens ,P. aeruginosa ,C.crescentus 等细菌。
自备试剂:
膜蛋白溶解液(取决于后续实验。如果后续实验为SDS-PAGE ,则用1×SDS-PAGE 上样液作为溶解液;如果用于2D 电泳,则使用1×等电点电泳上样液作为溶解液)。
组分Component
Solution A
Solution B
Solution C
DNase I powder 50assay 125mL 25mL 250ml 3.5mg Storage 4℃4℃4℃-20℃
REMARK:
50次的规格是指的每次40mL 菌液的小量提取,如果处理400mL 菌液,则本试剂盒能做5次。
储存条件
低温冰袋运输和4℃保存,DNase I 需低温保存,有效期一年。
使用参考
准备:第一次使用本试剂盒时需要将所有DNase I 干粉倒入溶液B 中,轻柔颠倒使DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存,用法一:小量制备(主要用于上样量比较小的SDS-PAGE 电泳等实验)
1、收集20-40mL 过夜培养的细菌饱和培养液(OD420在1.5左右即可),2500g 室温离心10分钟后弃上清。
2、加入2mL 溶液A ,轻柔吹打,将细菌重悬于溶液A 中。
3、2500g 室温离心10分钟后弃上清。
4、加入0.5mL 溶液B (必须已经提前加入了DNase I 干粉),轻柔吹打使细菌重悬。注:如果细菌起始量没有20-40mL ,溶液A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液A 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、用超声或French Press 方法裂解细胞。如果用French Press 方法,则需要处理至少两次,每次的压力为9.65×10E7(=14000psi )。注意:不论用哪种裂解方法,都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解,否则还需要重复细菌裂解过程,直到80%以上的细菌都裂解为止。
6、2500g 室温离心8分钟后小心转移上清到新的10mL-15mL 塑料离心管中(如Beckman Optima 台式超速离心机离心管),弃沉淀(未破裂细胞)。
7、在上清(细菌裂解液)中加入5mL 预冷的溶液C ,轻柔颠倒混匀后冰浴放置30-60分钟。其间可以轻柔颠倒混匀3-5次。
8、用Bechman Optima 台式超速离心机115,000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。
9、小心移弃上清,在沉淀中加入0.2mL 溶液A ,充分吹打混匀。
10、用Beckman Optima 台式超速离心机115,000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。
11、小心移弃上清,所得沉淀放-20℃长期保存,也可以直接加入0.1mL 自备的,跟后续实验兼容的缓冲液(如1×SDS-PAGE 上样液中,可从本公司购买),所得膜蛋白的浓度将在1mg/mL左右。
用法二:大量制备(主要用于上样量比较大的2D 电泳等实验)
1、收集200-400mL 过夜培养的细菌饱和培养液(OD420在1.5左右即可),2500g 室温离心10分钟后弃上清。
2、加入20mL 溶液A ,轻柔吹打,将细菌重悬于溶液A 中。
3、2500g 室温离心10分钟后弃上清。
4、加入5mL 溶液B (必须已经提前加入了DNase I 干粉),轻柔吹打使细菌重悬。注:如果细菌起始量没有200-400mL ,溶液A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液A 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、用超声或French Press 方法裂解细胞。如果用French Press 方法,则需要处理至少两次,每次的压力为9.65×10E7(=14000psi )。注意:不论用哪种裂解方法,都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解,否则还需要重复细菌裂解过程,直到80%以上的细菌都裂解为止。
6、2500g 室温离心8分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中,弃沉淀(未破裂细胞)。
7、在上清(细菌裂解液)中加入50mL 预冷的溶液C ,轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60分钟。注:可以在大烧杯中装冰,然后将装有样品的小烧杯放入,在放入干净的搅拌子,以最低速度搅拌。
8、用Beckman Type 55.2Ti 转头115,000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致。
9、小心移弃上清,在沉淀中加入2mL 溶液A ,充分吹打混匀。
10、用Beckman Type 55.2Ti 转头115,000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致。
11、小心移弃上清,所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在1mL 自备的,跟后续实验兼容的缓冲液(如1×等电点电泳上样液,可从本公司购买),所得膜蛋白的浓度在1mg/mL左右。
注意事项
1. 本试剂盒仅供科学研究使用。
2. 避免皮肤或粘膜与试剂接触。