一种载体构建的新方法_一步克隆法

第29卷第2期文章编号:10002375(2007)02湖北大学学报(自然科学版)()017804Vol.29　No12　一种载体构建的新方法:一步克隆法

欧阳平,李　玉,严　红,马立新

(湖北大学微生物与基因工程省重点实验室,湖北武汉430062)

摘　要:报道一种载体构建的新方法,在PCR引物设计时,相连片断设计15bp同源序列,PCR克隆目的

片段后,产生多个首尾具同源末端的片段,然后进行多片段定向连接、转化和重组子鉴定.以4片段拼接的叶绿体单交换质体载体pSMGA(pBluescriptⅡSK(+)2man2gfp2aadA)的构建为例,应用上述方法构建仅需做一次连接、转化即可.该方法设计操作相对简便,无需中间载体的构建,减少连接和转化次数.利用该法构建了10多个6kb以内的载体,证明这是一种简便、通用、高效并值得推广的构建小载体的方法.

　　关键词:载体构建;一步克隆;新方法;同源片段;水稻

　　中图分类号:Q786　　文献标志码:A

[1,2]片段拼接的复杂的载体时,往往设计,需要多次连接、转化,既费时又费力.GA(pBluescript

ⅡSK(+)2man2gfp2aadA)的构建为例,6.

1　材料与方法

1.1　材料　质粒pCM17和pBD2Leu2gfp(均为本实验室构建保存),Ex2TaqDNAPolymerase,PCRCoreKit,BglⅡ,EcoRV,HindⅢ,EcoRI(以上试剂均购自TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd),大肠杆菌(XL2Gold)用冷冻法自制超级感受态[3].

1.2　实验方案设计　载体pSMGA中的元件man,

aadA来自载体pCM17,gfp来自载体pBD2Leu2gfp,含

启动子,能自我启动发荧光.载体pSMGA中的元件

rAmp,rep来自载体pBlurscriptⅡSK(+).对于

pSMGA这个载体的构建,我们设计的实验方案是:先将

载体pBlurscriptⅡSK(+)(以下简称SK)用EcoRV线

性化,即形成两端平头.man,gfp,aadA相互间设计15

bp重叠片段,man的5’端与载体SK载体线性化后3’端

15bp同源,man的3’端引物照常设计,gfp的5’端与

man的3’端15bp同源,gfp的3’端引物照常设计,

aadA的5’端与gfp3’端15bp同源,aadA的3’端与载

体5’端15bp同源.利用四片段定向连接使它们的排列顺

序与载体pSMGA上的一致.方案如图1所示.

1.3引物设计与合成　根据pCM17载体上man和aadA图1　质粒pSMGA的构建　

收稿日期:20061031

基金项目:湖北省科技攻关项目(2003AA101C22)资助

),女,硕士生作者简介:欧阳平(1981　

第2期欧阳平等:一种载体构建的新方法:一步克隆法　179基因的序列设计引物,man在其正向引物5’加上pBluescriptⅡSK(+)载体经EcoRI切后3’端15bp同源序列,即F1:5’—ATCGATAAGCTTGATatgggggagttgcatttgtttaag—3’,F2:5’—tcactcaacgattggcgttaaag—3’;根据pBD—Leu—gfp载体上gfp基因的序列设计引物,在其正向引物5’端加上man3’端15bp同源序列和BglⅡ酶切位点agatct,即F3:5’—CCAATCGTTGAGTGAagatctgccgttcgctgtgtcgca—3’,F4:5’—ttcacttgtacagctcgtccatgc—3’aadA在其正向引物F5的5’端加上gfp3’端15bp同源序列,反向引物F6的5’端加上载体SKEcoRV酶切后另一端15bp同源序列,即F5:5’—AGCTGTACAAGTGAAatggcagaagcggtgatcg—3’,F6:5’—CTGCAGGAATTCGATttatttgccg2actaccttggtgatc—3’.引物设计后,由上海生工生物技术有限公司合成.

1.4　目的片段的PCR克隆体系和条件　PCR反应体系:模板DNA(质粒pCM17、pBD2Leu2gfp各稀释200倍)加5.0μL,引物1(10μmol/L)加5.0μL,引物2(10μmol/L)加5.0μL,dNTP(25μmol/L)加4.0μL,10×buffer(含Mg2+)加5.0μL,Ex2Taq酶加1.0μL,补加水到50μL.man,gfp,aadA的扩增程序为:94℃预变性5min;94℃,0.5min;54℃,0.5min;72℃,1.0min;共进行25个循环,最后72℃延伸7min.

1.5　目的片段的混合克隆　PCR后检测片断扩增情况,分别回收SK/EcoRV,man,gfp,aadA片断.依照片断浓度,使各片断以SK/EcoRV:man∶gfp∶aadA=0.6μL∶0.8μL∶0.7μL∶0.8μL混合均匀,冰浴5～10min即可.

1.6　大肠杆菌的常规转化[4～7]　在1.5mL0L,大肠杆菌感受态细胞60μL,轻柔混匀,冰浴30min,42℃,3NZY液体培养基,于37℃,250r/min培养1LB平板,37℃倒置培养16h.LB(固):1.0%,%NaCl,1.5%琼脂粉,121℃灭菌20min.2　结果

2.1　质粒pCM17和pBD2Leu2gfp的目的片段的PCR克隆结果　利用质粒pCM17为模板,分别以aadA,man的引物;以pBD2Leu2gfp为模板,以gfp的引物,均按照1.4的条件对man,gfp,aadA3个片段进行PCR克隆,并克隆到了预计大小的3个片段,即泳道中3和4的片段大小为1104bp,泳道中5和6的片段大小为792bp,泳道中7和8的片段大小为1003bp(如图2)并对它们进行了胶回收和酶切验证.

2.2　man,gfp,aadA与SK载体4个片段的处理、连接与转化结果　混合克隆片段按1.5的条件进行连接,再将连接物常规转化大肠杆菌(XL2Gold),取150μL培养物涂布补加了氨苄青霉素(Amp)LB(固)平板,37℃倒置培养16h后,在“蓝盾”502可见光凝胶透射仪下观察,平板上有发荧光的单菌落出现.

2.3　4个片段重组质粒pSMGA的验证　根据培养皿转化结果判断,载体片段SK上无gfp基因,扩增gfp片断的模板抗性为卡那霉素抗性,排除了片断模板污染,发荧光极可能是转化子.进一步接种抽质粒进行检验,抽质粒并电泳检测,挑取大小正确的几个样品进行酶切验证.

2.4　4个目的片段的重组子的酶切检测　引物设计时,片段gfp前引入了BglⅡ酶切位点,另外选取载体上原EcoRV左右两端相近的酶切位点HindⅢ和EcoRI.采用BglⅡ单切,HindⅢ单切,BglⅡ和HindⅢ双切,BglⅡ和EcoRI双切,HindⅢ和EcoRI双切验证.反应体系为10μL,10×buffer1.0μL,酶0.1μL,质粒8.9μL,双切时质粒为8.8μL,根据质粒的浓度可以适当稀释.酶切结果如图3所示.

BglⅡ和HindⅢ为单切点,分别处理后重组子应线性化,片断大小应为5.86kb;BglⅡ和HindⅢ双切后,应该切下man片断,大小为1.1kb;HindⅢ和EcoRI双切应该切下man2gfp2aadA,大小为2.8kb左右;BglⅡ和EcoRI双切后切下gfp2aadA片断,大小应该为1.8kb左右,均与酶切图谱相符,将该质粒命名为pSMGA,送上海生工测序.3730测序仪从正反两个方向测得的结果显示pSMGA为正确重组子,特别是SK与man接头处、man与gfp接头处,以及gfp与aadA接头处序列均正确,未引入冗余序列.仅man片断内有2个点突变,经分析这是由于Ex2taq聚合酶的保真性不高造成的,与本方法无关.

()

图3　重组子酶切检测

图2　PCR扩增man,gfp,aadA片断

M　EcoT14ⅠMarker

1　SK质粒

2　EcoRV酶切SK质粒

3,4　PCR扩增man片断

5,6　PCR扩增gfp片断

7,8　PCR扩增aadA片断

　M　EcoT14ⅠMarker1　SK质粒2　BglⅡ酶切3　HindⅢ酶切4　BglⅡ和HindⅢ酶切5　HindⅢ和EcoRI酶切6　BglⅡ和　

3　讨论

实验表明,,利用此法构建载体的具有以下优点:

3.1　,优势并不是很明显,但构建6kb以内的载体时,此法的优势是显而易见的.常规的载体构建方法在构建多片段拼接的载体时,往往设计、操作较麻烦,通常要构建多个中间载体,需要多次连接、转化,既费时又费力.而用此法构建载体,可以减少中间载体的构建,减少连接、转化次数,大大提高工作效率.如果应用常规的载体构建方法构建以上3片段拼接的水稻单交换质体载体pSMGA,需要做3次连接、转化,构建不同的中间载体2个,而应用以上方法构建此载体,仅需转化一次,无需构建中间载体,片断仅需混合冰浴10min.因此利用这种方法构建载体,不仅可节省大量时间和试剂,而且使载体的构建变得相对简便.

3.2　通用性　应用常规的载体构建方法构建以上3片断拼接的水稻单交换质体载体pSMGA,常需要引进3个以上片段上都没有的酶切位点,否则就需要做部分酶切,这给试验设计和操作带来不少麻烦.而利用此法构建以上载体,只在PCR引物设计时,在其5’端加上15bp的同源片断,利用PCR克隆目的片段,回收就可以进行多片断定向连接、转化、重组子鉴定.这样就可以不用寻找合适的酶切位点,也不用引进新的酶位点,不破坏目的片断的完整性,不引入冗余碱基,实现真正的无酶连接.这种载体构建方法具通用性,理论上可以用于任何载体的构建,尤其是元件小、元件多的载体的构建.因此,这是一种值得推广的载体构建的好方法.

3.3　经济性　采用这种方法构建载体只需要一次连接、转化就可以找到重组子,不仅提高了工作效率,更主要的是经济.本实验只需要在片断的正向引物中多引入15个碱基,就省去了后面常规方法的许多酶切、酶连、甚至载体去磷酸化的及多次转化等步骤.现在引物合成成本便宜,而普通的限制性内切酶成本颇高,通过一步克隆的方法就可以节省大量成本.

由于本实验的理论基础是大肠杆菌的体内同源重组以及大肠杆菌体内暂时一种不明的机制实现片断的无酶连接,对于大载体的构建具有一定的局限性.分析可能原因在于片断越大,刚性越强,各片断之间的同源片断就越难结合,另一个原因就是片断越大,同源片断越难设计,往往载体的一端和自身碱基同源重组或是片断与载体重组不在期望的位置发生,而在其它地方发生了同源交换,经我们实验6kb以内的载体构建是完全可以的.对于大载体构建,有文献报道了成功的两片断无酶连接[8],但是仅限于两片断连接.我们在本方法的基础上又引进了新的思路,适用于12kb以内的复杂载体的无酶构建,也

第2期欧阳平等:一种载体构建的新方法:一步克隆法　181获得了很高的效率(待发表).

综上所述,我们采用这种方法已成功地构建了几十个载体,证明这是一种简便、通用、高效的小载体构建的新方法.

参考文献:

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MT22cellscontainingmultipledefectiveprovirusesusingoverlappingpolymerasechainreaction[J].AnalBiochem,2004,329(2):281288.

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Aofconstructingvectors:one2stepcloning

OUYANGPing,LIYu,YANHong,MALi2xin

(HubeiKeyLaboratoryofMicrobiologyandGeneEngineering,HubeiUniversity,Wuhan430062,China)

Abstract:Anovelmethodofconstructingvectorswasdeveloped.Thereareseveralstepsasfollows:firstadding15bphomologousfragmentswhendesigningthePCRprimers,thencloningpurposefragmentsbyPCR,afterthatthefragmentswereputtogether,theywouldrecombineinanorientation,thenextstepistotransformthemixandfinallyidentifyingthetransformants.Let’staketheOryzasativasingle2crosschloroplastvectorpSMGA(pBluescriptⅡSK(+)2man2gfp2aadA)whichwasconstructedwithfourfragmentsasanexample,ifconstructedthevectorusingthemethodmentionedabove,itwoulddoonlyonerecombinationandonetransformation.Comparedwiththeclassicmethod,thisnewmethodcouldmakelessmediumvectors,dolessrecombinationsandtransformations.Scoresofexperimentshasprovedthatitisasimpleuniversalhigh2throughputmethodthatisworthpopularizingtoconstructthevectorswithin6kb.

Keywords:constructingthevectors;one2stepcloning;novelmethod;homologousfragments;Oryzasativa

(责任编辑　游　俊)