微生物实验报告细菌.

微生物实验报告

题目 年级专业实验者 学号 小组 成员 指导老师

一、实验目的

脓汁和粪便标本中病原菌的检测 2013级临床医学八年制

1. 了解细菌生长的基本营养条件，熟悉培养基的类型，学习并掌握培养基的原则与方法。 2. 掌握无菌操作技术，掌握病原菌的分离与培养方法。 3. 了解并比较细菌在固体、半固体和液体培养基的生长特征。 4. 学习并掌握空气及人体细菌检测学方法。

5. 掌握细菌涂片标本的制备以及革兰染色法，熟悉不同类型细菌的基本形态。 6. 掌握糖发酵实验、抗菌素敏感性实验和血浆凝固酶实验的原理与方法。 7. 从脓汁和粪便标本中分离培养和检测出病原体。

二、实验器材

1. 培养基的制备：干粉培养基、天平、蒸馏水、称量皿、药勺、锥形瓶、量筒、电炉、试

管、洗耳球、试管筐、移液管、棉塞、牛皮纸、橡皮筋、手套、石棉网 2. 空气与人体体表细菌学检查：琼脂培养基、酒精、碘酒

3. 细菌的分离培养：脓汁标本、粪便标本、伊红美蓝平板、营养琼脂平板、接种环、酒精灯、打火机

4. 细菌的纯培养：接种环、酒精灯、打火机、中性笔、斜面培养基

5. 细菌的形态学检测：斜面培养物、营养肉汤、生理盐水、镜油瓶、拭镜纸、吸水纸、载玻片、显微镜、接种环、酒精灯、打火机、中性笔、革兰染色试剂、液体培养基

6. 细菌的生化试验：葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、接种针、酒精灯、打火机、中性笔、菌液、营养琼脂平板、接种环、药物纸片（青霉素、庆大霉素、头孢曲松）、玻片、兔血浆、生理盐水

7. 细菌的血清学试验：玻片、福氏志贺菌诊断血清、生理盐水、接种环、酒精灯

三、实验方法与步骤

1. 培养基的制备

称量琼脂粉→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里→罩上硫酸纸、牛皮纸→ 用橡皮筋扎好 →放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）→灭菌

2. 空气与人体体表细菌学检查 2.1空气的细菌学检查

每组1个营养琼脂平板，选择实验楼女厕所→将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边→平板暴露于空气中15分钟→平板倒扣盖上→作标记→37℃温箱培养24小时→观察结果。 2.2人体体表细菌学检查

甲丙常规洗手，乙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁分别共用1个平板按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。

3. 细菌的分离培养 3.1 实验方法

平板划线法：借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。 3.2实验步骤

接种环烧灼灭菌→分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份，→烧掉接种环上多余的标本→冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）→接种环烧灼灭菌→将平板倒置37℃培养18～24h →观察结果 。 4. 细菌的纯培养

甲→普通平板→金黄色菌落(auratus，golden yellow)→1支斜面 乙→普通平板→白色菌落(albus，white) →1支斜面 丙→ EMB 平板→紫黑色菌落(atropurpureus)→1支斜面 丁→ EMB 平板→粉红色菌落(pink) →1支斜面

斜面正面上2/3作标记：组号 + 金黄、白色、紫黑、粉红。 5. 细菌的形态学检测 5.1革兰试剂染色

5.2显微镜油镜使用步骤

10×物镜→看清标本→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→ 擦镜纸拭去香柏油 →擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）

混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。 5.3肉汤接种法

接种环烧灼灭菌→分别在斜面培养物中挑取菌苔少许→立即移入肉汤培养基管中→在接近液面的管壁上轻轻研磨→沾取少量肉汤调和→混匀→试管口通过火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→35℃培养4~6小时

6. 细菌的生化试验 6.1细菌的糖发酵实验

接种针烧灼灭菌→用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔→分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内→接种环烧灼灭菌→将微量管平放在平板内→37℃培养过夜后→观察结果。 6.2药敏实验

接种环烧灼灭菌→分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布（如图6）→接种环烧灼灭菌→ 标记:青、头、庆 →镊子火焰消毒→贴青霉素、头孢曲松、庆大霉素纸片→ 按压→镊子消毒→倒置37℃培养 6.3凝固酶实验

取干净玻片一张→在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴，生理盐水1滴→接种环烧灼灭菌→冷却→分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量) 与血浆研磨混合→边混匀边观察结果→接种环烧灼灭菌→稍等片刻，观察结果 6.4动力实验

接种针烧灼灭菌→分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌→从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底→循原来的路线退出接种针→试管口迅速通过

火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→烧灼灭菌接种针→37℃培养24小时→观察结果

7. 细菌的血清学试验

取洁净的载玻片一张→将磨面近端设为对照区→滴加生理盐水15ul →远端设为试验区→滴加福氏志贺菌诊断血清15ul →接种环烧灼灭菌→用接种环分别取粉红色菌苔→研磨于盐水或血清内，混合均匀→接种环烧灼灭菌→载玻片来回倾侧→观察结果

四、结果与讨论

1. 人体体表细菌学检查

洗手前细菌较多，有黄色和白色两种菌；洗手后细菌总数没有明显减少甚至有增加，以白色菌为主。用碘酒擦拭过的手无明显的细菌菌落，空白对照无菌落。

洗手可能只能洗掉部分暂住菌（黄色），而不能完全去除手上的全部细菌，碘酒具有很好的杀菌功能，可基本杀灭手上的细菌。

2. 细菌的分离培养结果

标本 菌落颜色 形态特征

黄色

脓汁

白色

紫黑色

粪便

粉红色 半透明，直径1～2mm

圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、具有金属光泽、大不透明，菌落直径2mm 左右

而隆起、不透明，菌落直径2～

3mm

结果分析：

粪便标本在伊红美蓝平板上，形成的紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色，而致病菌不分解乳糖，菌落呈伊红的颜色，淡粉红色。

观察伊红美蓝平板，发现个别菌落中心黑色，边缘粉红色，此种类型的菌落多出现在划线密集，菌落较集中的地方，推测原因是，大肠杆菌利用完乳糖以后，就要利用蛋白质，蛋白质分解大多产生碱性物质，中和了乳糖分解时产生的酸，导致了大肠杆菌菌落颜色的改变。

3. 细菌的纯培养

从普通平板上挑选的黄色或白色菌落接种的斜面，观察菌苔的颜色与之前无明显差别；从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色和粉红色菌落失去了原来的颜色，都变灰白色，表面光滑湿润，这是因为水溶性色素只有在伊红美蓝中才能显现出紫黑色和粉红色。

4. 细菌的形态学检测 菌落来源 菌落颜色

油镜特征

金黄色

脓汁

白色

紫黑色

粪便

粉红色

呈紫红色，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌

呈粉红色，紫黑色菌呈长弧状，粉红色呈短杆状，散在排列，从形态上不能鉴

别是什么细菌。

分析讨论

革兰氏染色原理：G ＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G ˉ菌：肽聚糖层薄，

交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

综上所述，金黄、白色两种菌落，显微镜油镜下均为G+球菌，结合镜检特征可知这两株细菌属于葡萄球菌，再结合菌落色素，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。；紫黑色菌落，粉红色菌落，显微镜下均为G-杆菌。 5. 药敏实验

菌落 青霉素 头孢曲松 庆大霉素

黄色 + + +

白色 + + +

紫黑色 - + +

粉红色 - + +

备注：“+”为敏感，“-”为耐药 表 1药敏试验结果 分析讨论

纸片扩散法将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈。G +球菌对青霉素和头孢曲松敏感。 G -杆菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感。G +球菌和G -杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。 6. 凝血酶实验

致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白, 附着于菌体表面, 形成凝块。因此金黄色菌为有致病性的金黄色葡萄球菌，白色为无致病性的白色葡萄球菌。

7. 糖发酵实验与动力学实验

菌落 紫黑色

葡萄糖发酵现象 黄色，产酸又产气，

分解糖

粉红色

黄色，产酸不产气，

分解糖

分析讨论

具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中, 能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移动扩散生长，使培养基呈根须状或云雾状混浊状态。无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。所以紫黑色菌右鞭毛，粉红色菌无鞭毛。根据实验现象与生化反应鉴别表（图22）可判断出紫黑色菌为大肠埃希菌，粉红色菌为福贺志氏菌。。

8. 细菌血清学实验

在载玻片上滴加生理盐水的血液没有发生凝集，而滴加福氏志贺菌的血清发生了明显的凝集。

在适量电解质存在的情况下，颗粒性抗原(细菌) 与特异性抗体结合，如果比例合适，则出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。滴加生理盐水的血没有发生凝集，滴加福氏志贺菌

乳糖发酵现象 黄色，产酸又产气，分

解糖

动力试验现象 扩散生长，培养基呈扩散云

雾混沌状态

紫黄色，分解少量糖，沿穿刺线生长，穿刺线边缘

不产气

整齐，周围培养基清澈透明

的福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应，证明福氏志贺菌具有致病性。

综合实验结果

脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌；粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌，粉红菌落为福氏志贺菌，致病菌为福氏志贺菌。

五、注意事项

1. 平板划线要充分利用平板面积，不能划破琼脂； 2. 挑取菌苔时在平皿底部玻璃上，画个大圈选取菌落； 3. 药敏试验试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密

集为宜； 4. 在玻片凝集试验中来回侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显； 5. 糖发酵实验中培养管不能竖直放置，防止气体跑出； 6. 动力学实验接种环要直进直出；7. 实验过程始终要在酒精灯无菌操作区进行。