人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险
人抗凝血酶III 转基因羊的外源基因转移风险分析
青岛森淼生物技术研究所 山东青岛 266061
关键词:转基因羊;实时荧光定量PCR ;人抗凝血酶III ;基因转移
前言
随着生物技术的高度发展,转基因动物研究的不断深入和加快,转基因育种成为培养新品种的重要途径,商业化转基因动物即将面世,同时,与转基因相伴而生的潜在的安全问题已引起世界各国的关注和重视[1-2]。转基因动物是通过基因工程技术使生物遗传信息发生了转移、替换、融合和表达的遗传工程体,由于外源基因的插入,打破了原有的育种规律,改变了物种多样性局面,可能发生潜在的生物环境安全问题,造成重大经济损失,对人类生存造成威胁。因此,对转基因动物环境安全的检测和评价有利于保证人类健康和生态环境安全、促进转基因动物相关技术的快速健康发展。
基因转移是指转基因生物中转入的外来基因,转移到相邻的其他生物之中,从而改变其他生物的基因组成[3]。转基因植物发生基因转移可能引起的生态环境安全性问题已经引起广泛关注,而转基因动物发生基因转移的可能性一直没有被重视。因而研究转基因动物发生基因转移的可能性对于评价转基因动物环境安全性具有重要的意义。
本研究建立了利用实时荧光定量PCR 技术检测转基因山羊抗凝血酶III 基因的具体方法,并充分发挥青岛森淼实业有限公司的转基因羊群资源优势[4],开展抗凝血酶III (ATIII )转基因羊环境安全性评估的初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
野生型山羊、转乙肝表面抗原基因羊、转ß-干扰素转基因羊、转A TIII 基因羊、狗、鸡和鹅的血样采集于青岛森淼实业有限公司的转基因动物养殖基地;血液基因组提取试剂盒,购自美国QIAGEN 公司;TaqMan Universal PCR Master Mix,购自美国Applied Biosystems公司;Taqman 探针及引物由大连Takara 公司合成;其它普通生化试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
美国Applied Biosystems公司7500荧光定量PCR 仪和9700型PCR 仪。
1.3 引物及Taqman 探针设计
利用Primer Primer 5.0软件分析人A TIII 基因的序列(登录号:NM_000488),设计并合成
用于构建标准质粒的人ATIII 特异性引物(F :5’-gtgataggaactgtaacct-3’;R :5’-cggccagcaatcacaacag-3’)。利用Applied Biosystems 公司的Primer Express 3.0软件设计Taqman 探针和引物(F :5’-TGTGA TAGGAACTGTAACCTCTGG -3’;R :5’-GCTTGGCTGTGCAGA TGTC -3’; Taqman 探针:5’-(FAM) TGTCCTTGCTGCTCA TTGGCTTCTG (Eclipse)-3’)。利用BLAST 在线软件分析设计引物和探针序列的特异性。引物及探针委托大连Takara 公司合成。
1.4 血液基因组DNA 的制备
血样采用EDTA 抗凝,血液置于1.5 ml离心管中4 ℃保存备用。利用QIAGEN 离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组。
1.5 ATIII基因的扩增
以转ATIII 基因羊(A22)血液基因组为模板。PCR 扩增体系如下:25 μl的体系,DNA 模板3 μl,l0×Ex Taq bufer 2.5 μl ,dNTP(2.5 mM)2.5 μl ,引物F (10 pM),引物R (10 pM),Taq 酶0.2 μl,ddH 2O 补到25 μl。反应条件为94 ℃ 5 min;95 ℃ 30 S,55 ℃ 30 S,72 ℃ l.5 min,25个循环;72 ℃ 10 min。扩增片段大小为1263 bp,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收。
1.6 ATIII基因的克隆
利用DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII 基因PCR 扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书) ,胶回收产物连接到pMD18T 载体中,转化E.coli DH5α,挑取单克隆,PCR 鉴定,并测序鉴定。
1.7 质粒标准品浓度的计算
将上述质粒用紫外分光光度计测定260 nm与280 nm波长下的OD 值,判断其纯度(OD:260 nm/OD280 nm>1.8者为纯品) ,然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:每微升质粒拷贝数= (质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/lμl)×lμ]×10-9/2404697]×(6.02×1023个/mo1),其中:6.02×1023是阿佛加德罗常数;2404697是标准质粒的分子量。标准品作10倍梯度稀释,-20 ℃保存备用。
1.8 荧光定量PCR 检测
25 μl反应体系包括TaqMan Universal PCR Master Mix 缓冲液12.5 μl,血样DNA 模板10 ng ,引物和探针浓度按具体实验添加,体系用ddH 2O 补齐。特异性反应条件为:95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40 cycle。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。
1.9 敏感性评价及定量分析
RNA 标准品经1/10系列稀释,利用建立的检测体系对不同浓度的RNA 标准品进行荧光定量PCR 检测,以确定检测灵敏度。同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线,对检测样品进行定量分析。
1.10 特异性评价
利用建立的检测体系对转A TIII 基因羊血液基因组(A22)、非转基因羊血液基因组(转基因羊养殖基地外采集) 和小鼠血液基因组,等进行荧光定量PCR 检测,以验证其特异性。
1.11 样品检测
利用一次性5 ml注射器,采用颈静脉取血的方法采集山羊血液样品,共采集野生型山羊血样9个(山羊编号为11、64、82、83、86、87、2-5、3-10)、采集转乙肝表面抗原基因羊血样10个(编号为H11、H16、H17、H26、H42、H48、H50、H55、H65、H66)、采集转ß-干扰素转基因羊血样10个(编号为B5、B10、B17、B18、B19、B20、B21、B22、B23、B24)、采集转A TIII 基因羊血样8个(编号为A08、A23、A38、A39、A41、A43、A46、A54);采用腿静脉采血方法,采集狗静脉血样4个;采用翅静脉采血方法,采集鸡血样8个、鹅血样8个。提取血液基因组,做模板,进行荧光定量PCR 检测,以评价ATIII 基因是否发生转移。 2 结果
2.1 人ATIII 标准质粒的构建
以转ATIII 基因羊(A22)血液基因组为模板,PCR 扩增得到1300 bp 的片段(图1),胶回收后克隆到pMD18T 载体中。转化E.coli DH5α,挑取2个单克隆,PCR 鉴定均为阳性(结果未给出),进一步测序证明序列完全正确。
M
1
ATIII
图1 PCR克隆人ATIII 基因片段。泳道M :DL2000 marker;泳道1:ATIII 基因PCR 扩增片段。 Fig. 1 Identification of PCR products of ATIII. Lane M: DL2000 marker; Lane 1: The fregment of ATIII.
2.2 引物和探针浓度的优化
以相同量的阳性核酸为模板,引物和探针的浓度分别选取了100、150、200、250和300
nM 五个浓度梯度,反应条件为二温循环(95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40 cycle),利用矩阵法对引物和探针的浓度进行优化,以阈值(Ct 值)最小的条件为最佳反应条件。在试验设计的范围内,当引物和探针的浓度增加,Ct 值相应减小,而引物和探针的浓度在250和300 nM 时Ct 值没有明显变化。因而我们选择引物为300 nM 、探针为250 nM 作为后续的试验条件。
2.3 标准曲线及荧光定量PCR 灵敏度
以十倍稀释的标准质粒(1到1×109 copy/μl,共十个梯度)为模板进行扩增的扩增曲线见图2,标准曲线如图3。结果表明,FQ-PCR 的灵敏度可以达到1 copy/μl,但是当浓度为1 copy/μl时,Ct 值的重复性较差;标准曲线的斜率为-3.072,R 2为0.992。
图2:荧光定量PCR 检测ATIII 标准质粒(1到1×109 copy/μl)的扩增曲线。
Fig. 2 Amplication curve of real time PCR of ATIII.
图3 定量PCR 检测ATIII 的标准曲线
Fig. 3 Standard curve of real time PCR for ATIII
2.4 荧光定量PCR 检测人ATIII 基因的特异性
为了研究FQ-PCR 检测人A TIII 基因的特异性,我们同时检测了转ATIII 基因羊血液基因组(A22)、非转基因羊血液基因组和小鼠血液基因组,每个反应加入10 ng基因组DNA 。如图4所示,只有转ATIII 基因的羊血液基因组中能检测到ATIII 的表达,证明了FQ-PCR 的特异性。
1
2、3
图4 定量PCR 的特异性试验。1:以转ATIII 基因羊血液基因组为模板;2:以非转基因羊血液基因组为模板;
3:以小鼠血液基因组为模板
Fig. 4 The specificity of real time PCR for ATIII. 1: the detection of blood genomic DNA of transgenic goat carrying antithrombin III gene; 2: the detection of blood genomic DNA of wild type goat; 3: the detection of
blood genomic DNA of mice
2.5 荧光定量PCR 检测
利用QIAGEN 离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组,提取的基因组利用紫外分光光度计测定OD260 nm/OD280 nm,确定基因组DNA 的纯度和浓度,通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 的完整性。检查结果表明,提取的基因组DNA 无RNA 、蛋白污染,无降解。
利用上面建立的转基因羊血液中人ATIII 实时荧光定量PCR 检测方法,检测血液基因组中ATIII 基因DNA 的含量。检测结果显示,野生型山羊血液中、ß-干扰素和乙肝表面抗原转基因羊血液中均未检测到A TIII 基因(图5);狗、鸡和鹅血样中也未检测到ATIII 基因的存在(图6);所有ATIII 转基因羊血样中均检测到ATIII 基因(图7)。结果表明,ATIII 转基因羊的外源基因(人ATIII 基因)在种内和种间均未发生基因横向转移。
标准质粒S t a n d a r d p l a s m i d
图5 定量PCR 检测野生型山羊、ß-干扰素和乙肝表面抗原转基因羊血液样品中ATIII 基因
Fig. 5 The detection of blood genomic DNA of transgenic goat caring Hepatitis B surface antigen gene or IL6
gene, and wild type goat
图6 定量PCR 检测狗、鸡和鹅血液样品中ATIII 基因
Fig. 6 The detection of blood genomic DNA of dog, hen and goose
图7 FQ-PCR检测ATIII 转基因羊血液样品中ATIII 基因
Fig. 7 The detection of blood genomic DNA of transgenic goat caring antithrombin III gene
d i m s a l p d r a d n a t S 粒质准标 e l p m a s 品样
3 讨论
转基因植物的外源基因可以通过花粉授精杂交、种子传播等途径在种群之间扩散;而转基因动物发生基因转移的可能性比较小[5-7]。然而,由于基因操作使用的载体经常为病毒载体,在特定的情况下有可能恢复病毒的活性,从而导致外源基因的扩散;另外,外源基因有可能整合到体内病原微生物的基因组中,从而随病原微生物的传播而转移到其它宿主体内。由于转基因植物主要是通过杂交从而导致基因转移,因而受体体内的外源基因整合到几乎所有的细胞基因组中,易于检测;转基因羊个体较大,在饲养过程中通过严格管理,不会发生杂交而导致的基因转移,而通过病原微生物等手段发生的基因转移只可能导致受体动物的部分组织或细胞接受外源基因,所以对于检测的灵敏度和组织选择要求严格。本实验选择了血液作为检测对象,不仅是由于样品容易采集,更主要原因是其全身循环的特性使其最有可能检测到外源基因的存在。
为了能够灵敏的检测到微量的A TIII 基因,本研究建立了灵敏、特异的实时荧光定量PCR 检测人ATIIII 基因的技术方法,最低能检测到1 copy的ATIII 基因,并且检测特异性高。在此基础上,开展了抗凝血酶III 转基因羊环境安全性评估的初步研究。完成了与ATIII 转基因羊密切接触的同种和异种动物血液基因组中ATIII 基因的检测工作(共57个样本),结果表明人ATIII 基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生转移,提示转基因羊对于环境是安全的。在后续的实验当中,我们将通过扩大检测样本数目和种类,全面的评价转基因羊的环境安全性。
参考文献(References)
[1] Adow D A, Zwahlen C. Assessing environmental risks oftransgenic plants[J]. Ecology Lette, 2006, (9):196-214
[2] 施巧婷, 魏成斌, 李建林, 等. 转基因生物的安全性[J]. 中国农学通报, 2009, 25:66-70
SHI Qiao-ting, WEI Cheng-bin, LI Jian-Lin, et al. The Safety of Transgenic Biology[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25:66-70
[3]Top E, Mergeay M, Springael D, et al. Gene escape model: transfer of heavy metal resistance genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on agar plates and in soil samples[J]. Applied and environmental microbiology, 1990, 56:2471-2479
[4] 邹贤刚, 袁三平, 鲜建, et al. 转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白质(rhATⅢ) [J]. 生物工程学报, 2008, 24:117-123
XOU Xian-gang, YUAN San-ping, XIAN Jian, et al. Large Scale Production of Recombinant Human Antithrombin Ⅲ(rhAT Ⅲ) in Transgenic Cloned Goats[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2008, 24:117-123
[5]Singh OV, Ghai S, Paul D, et al. Genetically modified crops: success, safety assessment, and public concern[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2006, 71:598-607
[6]Lee D, Natesan E. Evaluating genetic containment strategies for transgenic plants[J]. Trends in biotechnology,
2006, 24:109-114
[7]Velkov VV , Medvinsky AB, Sokolov MS, et al. Will transgenic plants adversely affect the environment?[J]. Journal of biosciences, 2005, 30:515-548