大豆糖蛋白的分离纯化及结构分析

大豆糖蛋白的分离纯化及结构分析

詹　玲，潘思轶＊

（华中农业大学食品科技学院，湖北　武汉　　　　　　４３００７０）

摘　　　要：通过ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５２离子交换层析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００凝胶层析从大豆中提取纯化一种糖蛋白，并对其结构进行了初步分析。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测纯度，并测定其分子质量的大小，测定结果为６１０００，蛋白质含量为３０．５５％；β－消除反应说明其为Ｏ－连接型糖蛋白，红外光谱法推断其含有α型糖苷键。关键词：大豆糖蛋白；分离纯化；结构分析

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｓｏｙｂｅａｎ

ＺＨＡＮ　Ｌｉｎｇ，ＰＡＮ　Ｓｉ－ｙｉ＊

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｗｕｈａｎ　　　　　　　４３００７０，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　　：Ａ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５２　ＩＥＣ（Ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　ａｎｄ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００　ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ－ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）．　Ｔｈｅ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｓｅｄ　ｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　３０．５５％　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｉｓ６１０００．β－ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ　ｌｉｎｋａｇｅ　ａｎｄ　ＩＲ　Ｓｐｅｃｔｒａ　ｉｓ　α－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｌｉｎｋａｇｅ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ

中图分类号：Ｑ５１３．２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：　１００２－６６３０（２００６）１２－０５９４－０３

糖蛋白是指糖和蛋白质之间，以蛋白质为主，其一定部位以共价键与若干糖分子链相连而构成的分子［１］。根据糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基脱水所形成的糖苷键的不同，可分为Ｎ－糖苷键和Ｏ－糖苷键两大类［２］。糖蛋白在自然界广泛存在于动物、植物和某些微生物中，在生物体内它们以各种形式存在［３］。近年来随着对糖蛋白研究的深入，发现糖蛋白在生物体内起着重要的作用，而这些作用与糖链的结构密切相关。本文研究了大豆糖蛋白的提取、纯化方法，对糖蛋白的结构进行了初步分析，为后续的研究打下基础。１１．１１．１．１１．１．２

材料与方法材料和试剂

材料

大豆粉：干大豆粉碎过２００目筛。

主要试剂

ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００

（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），标准分子质量蛋白质（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。１．２

仪器与设备

电泳仪　　　　北京六一；紫外可见分光光度计　　　　日本；红外光谱仪　　　　美国；冷冻干燥机　　　　瑞典；ＨＤ－９３－１

方法

大豆糖蛋白的分离提取

核酸蛋白检测仪。１．３１．３．１

将干燥脱脂后的大豆粉按一定的料液比加入到０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ６．８　ＰＢＳ（磷酸缓冲液）中，４℃下浸提过夜，离心后取上清液，在冰浴条件下用（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀，静置后离心。沉淀物为糖蛋白粗品，粗品用０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２ＰＢＳ透析，备用。１．３．２

大豆糖蛋白粗品纯化

取大豆糖蛋白粗品若干，用０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２　ＰＢＳ

溶解。将活化后的ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５２填料装柱（１．６×６０ｃｍ），用０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２　ＰＢＳ平衡，上样后分别用０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２　ＰＢＳ，０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２　ＰＢＳ－０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ洗脱和０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２　ＰＢＳ－０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ洗脱，洗脱液

收稿日期：２００６－０７－１５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊通讯作者

基金项目：湖北省新世纪高层次人才工程入选人员科研择优资助项目（鄂人［２００３］３１号）１９８１

用核酸蛋白质检测仪检测蛋白含量以及用苯酚－硫酸反应检测糖含量，收集重合峰，将收集液透析浓缩后上Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００（１．６×５０ｃｍ）凝胶层析柱，用０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２　ＰＢＳ－０．０５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ洗脱，用同样的检测方法检测蛋白质和糖含量，收集对称重合峰，收集液用蒸馏水透析后，冷冻干燥，得到一种纯化的大豆糖蛋白。１．３．３

大豆糖蛋白的蛋白质和糖含量的测定

蛋白质含量的测定用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）为标准蛋白［５］。糖含量测定采用苯酚－硫酸法，以葡萄糖为标准糖［１０］。

大豆糖蛋白的纯度和分子量测定

采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳法来鉴定提取的大豆糖蛋白的纯度。同时用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳法测定大豆糖蛋白的分子量，以胰蛋白酶抑制剂、牛碳酸酐酶、兔肌动蛋白、牛血清白蛋白和兔磷酸化酶Ｂ作相对分子质量标准，用各个蛋白的相对迁移率对分子质量的对数作图，得到其相对分子质量［４，５］。１．３．５

大豆糖蛋白的糖肽键特征分析

糖蛋白或糖肽的β－消除反应，能够把与肽链上丝１．３．４

凝胶层析柱进一步分离纯化，洗脱曲线如下，收集糖和蛋白质含量重合的组分，透析后冷冻干燥，即为大豆糖蛋白纯品。

３０２５吸光值

２０１５１０５００

１０

２０管数

图２　　　Sephadex G-200 SEC 凝胶层析洗脱曲线图Fig.2 Elution curves of the soybean glycoprotein on

Sephadex G-200 SEC

３０

４０

糖含量蛋白质含量

２．２

大豆糖蛋白纯度和分子量的测定

大豆糖蛋白纯品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图谱如下，分别

经过蛋白质染色［８］和糖染色［９］，在相同位置出现一条染色带，表明这种蛋白质是纯化的糖蛋白。通过大豆糖蛋白的相对迁移率可知其分子量为

６１０００。

氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来，而与天冬氨酰相连的Ｎ－型糖链则不能被稀碱水解。因此通过测定碱处理前后紫外吸收光谱的变化，可确定糖肽键的类型［６］。１．３．６

大豆糖蛋白的红外光谱分析

用ＫＢｒ压片，机型为Ｎｉｃｏｌｅｒ－ＳＸ－１７０型红外光谱仪。２２．１２．１．１

结果与分析大豆糖蛋白的纯化

ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５２离子交换层析［７］

ＰＢＳ缓冲液提取的大豆糖蛋白粗品经过ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕ－ｌｏｓｅ　５２离子交换柱分离，洗脱结果如下，收集第三组峰进行后续的样品纯化。

１６１４１２１０８６４２００

１０

２０管数

图１　　　　　DEAE-Cellulose 52 IEC 离子交换层析洗脱曲线图Fig.1 Elution curves of the soybean glycoprotein on

DEAE-Cellulose 52 IEC

图３　 SDS-PAGE电泳图谱

Fig.3 The SDS-PAGE photography of the soybean glycoprotein

相对迁移率

０．０．０．０．４．２

４．４

４．６

４．８

５

５．５

吸光值

糖含量蛋白质含量

３０４０

标准蛋白质分子质量的对数图４　　　质量标准曲线图Fig.4 Calibration curve

２．３大豆糖蛋白糖肽键特征分析

２．１．２

Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００凝胶层析

将上述第三组峰级分透析浓缩后经Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２００取纯品大豆糖蛋白１０ｍｇ溶于５ｍｌ　０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ溶液中，３０℃反应２０ｈ，测定碱处理前后２４０ｎｍ处氨基酸

含量的变化。由图可看出大豆糖蛋白纯品经β－消除反应后，在２４０ｎｍ处有明显的吸收峰，因此可说明其为Ｏ－糖蛋白。２．４

大豆糖蛋白红外光谱分析

在３５００～３２００ｃｍ－１之间的宽峰是Ｏ－Ｈ和Ｎ－Ｈ的伸缩振动，说明存在分子间和分子内的氢键。３０００～２８００ｃｍ－１的峰是糖类Ｃ－Ｈ伸缩振动，１４００～１２００ｃｍ－１的一组峰是Ｃ－Ｈ的变角振动。根据这两组峰可判断该物质是糖类化合物。１６５０ｃｍ－１的峰是乙酰氨基中的Ｃ＝Ｏ伸缩振动。１２５０～９５０ｃｍ－１之间的一组强峰是吡喃糖环的醚键和羟基的吸收峰。８４０ｃｍ－１的吸收峰为吡喃糖α型的Ｃ－Ｈ平伏键［１０，１１］，表明大豆糖蛋白中含有α型糖苷键。３

图５　　　　大豆糖蛋白的考马斯亮蓝染色和糖染色

Fig.5 Coomassie Brilliant Blue G-250 Staining and Shiff

Staining of the soybean

glycoprotein

结　　论

研究表明通过对脱脂大豆粉的浸提，硫酸铵沉淀以及离子交换层析和凝胶过滤层析，得到一种纯化的大豆糖蛋白。其蛋白质含量为３０．５５％，分子质量约为６１０００，β－消除反应证明它是Ｏ－糖蛋白，红外光谱分析其含有α型糖苷键。

参考文献：

［１］［２］

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科技出版社，　１９９３．

图６　　　β－消除反应前后的紫外扫描图

Fig.6 UV-spectra of the soybean glycoprotein before and after

alkali

treatment

［３］［４］［５］［６］［７］［８］

４５

４０３５３０２５２０１５１０５４０００

透光率（％）

３０００２０００１０００

［９］［１０］［１１］

波数（ｃｍ－１）

图７　　　大豆糖蛋白红外光谱图

Fig.7 Infrared absorption spectra of the soybean

glycoprotein