噬菌体展示技术及其应用

动物医学进展,2008,29(1):60-63噬菌体展示技术及其应用

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刘相叶,邓洪宽,吴秀萍,王学林,于申业,于艳玲,刘明远

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(吉林大学畜牧兽医学院人兽共患病教育部重点实验室,吉林长春130062)

摘 要:噬菌体展示技术是一项新兴的分子生物学技术;该技术将基因型和表现型有效地联系起来,是后基因组时代的有力工具。目前用于构建展示文库的噬菌体主要有丝状噬菌体、K噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体;它们所展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。随着此项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已在新型疫苗的研制、酶抑制剂的筛选、医学诊断和治疗、多肽药物的开发、蛋白质相互作用的研究等领域得到了广泛的应用,并显示了良好的应用前景。 关键词:噬菌体展示技术;原理;应用

中图分类号:Q782

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2008)01-0060-04

1985年,美国Missouri大学的SmithGP[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程手段改造,他把EcoRÑ内切酶的部分基因片段与丝状噬

菌体的次要衣壳蛋白pÓ(proteinÓ)基因融合,获得的重组噬菌体能被抗EcoRÑ内切酶的抗体所识别,由此建立了噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)。噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,为筛选到目的蛋白或多肽奠定了基础。1 噬菌体展示技术的原理

噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上,使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白,呈现在噬菌体表面,被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子,采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体,最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体;外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。2 噬菌体展示系统的类型

2.1 丝状噬菌体展示系统

丝状噬菌体属于单链环状DNA病毒,编码10

[2]

种蛋白质,其中与噬菌体展示有关的是pÓ和pØ衣壳蛋白。pÓ蛋白位于噬菌体颗粒的一端,有3个~5个拷贝,可在N端、近N端或N端与C端的柔性连接区融合外源肽或蛋白质。pÓ蛋白对展示的外源多肽或蛋白质的大小无严格限制,但由于pÓ蛋白的拷贝数只有3个~5个,在免疫学和生物疫苗研制中受到了限制。pØ蛋白位于噬菌体颗粒的两侧,一般在N端或近N端融合外源序列。由于pØ分子较小,只能融合较小的外源肽段,携带肽段太大会影响外壳的组装,使其失去感染力。但它的拷贝数多,因此该系统一般用于筛选亲和力较低的配体,高拷贝pØ蛋白在疫苗开发上具有潜在的应用价值。

2.2 K噬菌体展示系统

K噬菌体是最早使用的克隆载体,其两端为不闭合的线形双链DNA,末端为长12个核苷酸的互补单链。K噬菌体展示系统是将外源序列插入噬菌体头部组装必需的D蛋白的N端或C端,或主要尾部蛋白PV的羧基端折叠区(非功能区),实现外源蛋白的表面展示。K噬菌体是在宿主细胞内完成装配的,无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外,可展示有活性的大分子蛋白(100ku以上蛋白)及对宿主细胞有毒性的蛋白,适用范围极广。

2.3 T4噬菌体展示系统

T4噬菌体展示系统是将外源肽/蛋白质与T4

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收稿日期:2007-09-05

基金项目:863计划生物和医药技术领域基金(2006AA02Z451)

作者简介:刘相叶(1983-),男,山东沂源人,硕士研究生,主要从事人兽共患寄生虫病的分子生物学与免疫学研究。

刘相叶等:噬菌体展示技术及其应用

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噬菌体的小外衣壳蛋白C端融合而被展示,展示方法是利用一个选择性载体(或称之为整合载体),将融合有外源序列的小外衣壳蛋白(smalloutercap-sidprotein,SOC)融合基因同源整合入缺失SOC的T4基因组中,选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体,即可将外源肽/蛋白质展示于噬菌体表面。SOC具有与噬菌体颗粒表面专一结合的能力,因此还可用体外组装的方法实现展示。方法是将SOC及其融合衍生物在大肠埃希菌中表达,然后分离该融合蛋白,纯化后,加入到缺失SOC的噬菌体颗粒或多聚头部,结合后即可达到展示目的。T4噬菌体载体可以体外组装且系统容量大(35ku以上),拷贝数高,但由于其采用的是C端融合,这对研究蛋白质N端的功能不适合,而使它在蛋白质生物研究中的应用受到局限。

2.4 T7噬菌体展示系统

T7噬菌体衣壳蛋白通常有两种形式,即10A(344个氨基酸)和10B(397个氨基酸),独特的10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面,所以被用作噬菌体展示。展示在T7噬菌体表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来,因而其表面展示多肽和蛋白的范围较广。T7噬菌体展示系统可以在其表面以高、中、低拷贝表达各种蛋白。极高拷贝数载体适合用于低亲合力的结合域,中拷贝展示载体适合用于分析中等亲和力的结合域,低拷贝数载体适合用于分析高亲和力结合域。T7噬菌体展示系统是通过C端融合表达蛋白,插入片段被克隆到T7噬菌体载体基因10的C端。因此,即使插入片段内含有终止密码子,同样也可以被其表达和展示。3 噬菌体展示技术的应用3.1 在新型疫苗研制方面的应用

传统疫苗主要为减毒活疫苗或死疫苗,这种方法只能获得部分保护力,而且操作繁琐,又有一定危险性,用人工设计和合成疫苗将是一种必然的趋势。噬菌体表面展示技术为基因工程疫苗的筛选和设计提供了有效手段。王桂云等报道,利用噬菌体展示技术将丝状噬菌体fd基因8克隆入pKK223-3质粒中,将白色念珠菌特异表位基因插入到修饰后的质粒载体中,制备了杂合噬菌体。利用纯化的该表位抗原PA免疫小鼠,结果表明,该噬菌体-表位抗原PA在有、无佐剂存在的情况下均刺激机体产生抗体。免疫后小鼠脾淋巴细胞在有、无佐剂的情况下均有明显增殖,未见明显的毒副作用,具有良好的安全性。此法提示,用噬菌体展示某些特异性抗原,[4][3]

固相化的抗丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)单克隆抗体从噬菌体肽库中筛选HCV蛋白的模拟表位,并且用竞争结合实验证明了其特异性,为HCV的治疗和疫苗的研制提供了新的思路。李晓慧等[5]采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子(vascellumeendodermisgrowthfactor,VEGF)重组T7噬菌体疫苗,证明该疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受,可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体,并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应。噬菌体展示技术作为一种新型技术,将成为简单、有效、有前途的可以用来表达候选疫苗表位的工具。

3.2 在酶抑制剂筛选中的应用

具有生物活性的小肽中有酶抑制剂,它们有重要的基础研究及应用价值。利用噬菌体肽库寻找抑制酶活性的肽段的方法非常有效,用这一技术己经成功地筛选得到多种高活性的酶抑制剂。DennisMS等

[6]

从噬菌体肽库中筛选到能非竞争地抑制F×a

活性的肽段。该肽段有很高的特异性和很强的亲和性,对F×a结构的分析表明,此肽段结合在己知活性位点之外的区域,肽段与此位点结合后通过别构效应来抑制F×a的活性。李家大等以黑曲霉葡萄糖淀粉酶为靶分子,从噬菌体多肽库中经过3轮生物淘选筛选得到3个特异性结合的噬菌体克隆,分别命名为GB1、GB2和GB3。化学合成了环状多肽KCH-FEECLAY,其序列对应结合力最强的一个克隆GB1的N端10个氨基酸残基。该多肽可以竞争性地抑制黑曲霉葡萄糖淀粉酶以及大鼠小肠的A-葡萄糖苷酶。DengS等利用噬菌体展示技术,以抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为靶分子,从随机七肽库中通过4轮筛选,获得了能与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合的多肽;采用间接竞争ELISA,筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B1的阳性克隆子,为酶抑制剂的研制奠定了基础。3.3 在医学诊断和治疗方面的应用

噬菌体抗体库制备的抗体一般是基因工程抗体中的小抗体,主要含有抗原结合部位。由于它们普遍具有分子小、穿透力好、本底低等特点,因此最适用于放射显像诊断。若将其连接上其他的效应分子(如毒素、放射性同位素、化学药物等),可用于肿瘤的免疫放射治疗及其定位诊断[9]。施明等[10]利用噬菌体随机15肽库确定系统性红斑狼疮(SLE)相关多肽的研究中,经3轮筛选出的肽段分别与20例SLE病人及20例正常人血清反应,结果有显著性差[8]

[7]

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动物医学进展 2008年 第29卷 第1期(总第173期)

新的途径,为将来研制相关诊断试剂创造了条件。MacholdKP等[11-12]用噬菌体展示技术表达的一种肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)颉颃剂,将此颉颃剂用于治疗难治性贫血(refractorya-nemia,RA)患者,不论单独使用还是与其他药物合用,症状都得到明显改善。噬菌体肽库表达的抗体有目的的经过修饰后可以具有好的作用,用于提高治疗的效果,放射性元素标记的抗体还可使肿瘤成像或用于靶向治疗。

3.4 在多肽药物开发中的应用

由于噬菌体展示肽/蛋白质的结构与功能常常与天然肽/蛋白质具有同样或极为相似的结构与功能,利用此特点,在天然蛋白质或特定功能的框架分子噬菌体展示文库中,以一定功能的靶分子筛选,可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白,这些肽段可以作为侯选药物进行开发。FerrerM等[13]用噬菌体展示技术得到了能与人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)gpl20结合的12肽,并发现它能抑制病毒与CD4的结合。DelanoWL等[14]得到了能与IgGFc段结合的噬菌体肽,并发现它的细胞结合位点也能与至少4种天然的蛋白结合。TakagiT等[15]用肠炎肠黏膜和正常的肠黏膜对噬菌体7肽库进行了多轮筛选,结果显示SQSHPRH对肠炎肠黏膜结合率高,为开发治疗结肠炎药物奠定了基础。这对于设计和筛选具有较小副作用的侯选药物,有不可估量的价值。目前该技术己广泛用于艾滋病、心血管病、组织器官移植、神经性疾病等领域药物的研究和开发,并已筛选出大量的受体颉颃物。3.5 在肿瘤研究中的应用

肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞会表达一些正常组织所没有的特异性抗原,分析这些抗原的结构和功能,对肿瘤的早期诊断和靶向治疗都有重要意义。利用噬菌体展示文库可以筛选得到这些特异性抗原的模拟表位,从而为肿瘤的进一步研究奠定基础。XuL等用胃癌单克隆抗体MG7-Ab分别对两个噬菌体展示的随机9肽库进行亲和、富集和筛选,并进行结合活性检测,得到具有相对保守性的表位信息,为进一步研究胃癌相关抗原MG7-Ag与单抗结合的结构基序奠定了基础。利用噬菌体展示文库可以筛选得到这些特异性抗原的模拟表位,从而为肿瘤的进一步研究奠定基础。RomanovVI等

[17]

[16]

2b的扩散。ZhangY等用结肠癌细胞SW480和人正常的肠上皮细胞对噬菌体7肽库进行了多轮筛选,结果显示CP15(VHLGYAT)与结肠癌细胞SW480结合率高,而对正常的肠上皮细胞几乎不结合,为诊断结肠癌和开发治疗结肠癌药物奠定了基础。

3.6 在蛋白质相互作用研究中的应用

噬菌体展示的多肽文库是由特定长度的随机短肽序列组成,理论上文库中包含了某一固定长度的所有氨基酸。用靶蛋白(如受体、抗体等)对该随机文库进行亲和淘筛,就可以获得与之结合的短肽序列。对所得序列测定分析,并合成相应的短肽,从而可以来研究两个蛋白质之间的相互作用。近年来,研究者利用这种方法,已经成功鉴定出多个重要大分子,如生长激素受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体和TNF-A受体的激动剂和颉颃剂[19-20]。为了研究胰岛素与其受体的相互作用,PilluflaRC等[19]筛选到10个能竞争与胰岛素受体结合的多肽。根据实验结果,大致可分为3个结合位点。其中位点1结合的多肽有7个,在胰岛素依赖的脂肪细胞多肽中起激动剂作用,位点2和位点3的结合多肽在磷酸化和脂肪细胞实验中起颉颃作用。黄英等[21]应用T7噬菌体展示技术以HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,从而确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为Smadinteracting-protein1(SIP1),为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供了重要依据;还用同样的方法筛选到了乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)PreS1的相互作用蛋白细胞色素C氧化酶Ñ(cytochromecoxidasesubunitÑ,COX1)[22]。这些研究表明,噬菌体展示技术可用于阐明受体的分子结构,以位点特异的方式确认其生物活性所需要的关键区域。4 展望

由于噬菌体展示技术能够有效地实现基因型和表现型的体外转换,使研究者可以在基因分子克隆的基础上,较准确地实现蛋白质构象的体外控制,从而可获得具有良好生物活性的表达产物。噬菌体展示技术正步入发展成熟阶段,近几年来该技术显示出非常好的实用性。因此,噬菌体展示技术已经广泛的应用于新型疫苗的研制、医学诊断、多肽药物研究、抗肿瘤等领域。可以预见,随着展示载体的不断发现以及展示文库筛选技术的不断改进,它将在生命科学领域产生极其深远的影响。参考文献:

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用

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PhageDisplayTechnologyandItsApplication

LIUXiang-ye,DENGHong-kuan,WUXiu-ping,WANGXue-lin,

YUShen-ye,YUYan-ling,LIUMing-yuan

(KeyLaboratoryofZoonoses,MinistryofEducationofChina,CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China)

Abstract:Phagedisplaytechnologyisanewmolecularbiologytechnique,whichcaneffectivelylinkedgeno-typeandphenotypeinasamebody,isandbecomeapowerfultoolinthepost-genomeera.Currently,themainphageusedtobuildphagedisplaylibraryincludesfilamentousphage,Kphage,T4phageandT7bac-teriophage.Theexogenousproteinthatwasdisplayedcanalsokeeprelativeindependentactivityinthespatialstructureandbiologicalactivity.Withtheimprovementanddevelopment,thistechniquehasbeenusedwidelyinthedevelopmentofnewvaccines,theenzymeinhibitorscreening,medicaldiagnosisandtreatment,peptidedrugdevelopment,proteininteractionandsoon.Furthermore,ithasdemonstratedagoodprospect.

Keywords:phagedisplaytechnology;principle;application