聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法分离牛血清蛋白
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法分离牛血清蛋白
一、原理
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子的大小，形状的不同，在电场的作用下，产生不同的速度而分离的方法。
它具有分子筛效应、电荷效应、浓缩效应三重作用。
在这三重效应的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白质分离开来。
二、实验仪器
电泳仪
电泳槽
注射器
长针头
吸管
培养皿
三、实验试剂
三羟甲基氨基甲烷（简称Tris ）
A 、B 、C 、D 、E 、F 各贮备液，然后冷藏于4℃条件 贮备液的配制：按下表配制
下，以防变质。
染色液： 0.05%氨基黑10B 溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。
脱色液：7%醋酸溶液。
电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris 缓冲液）：甘氨酸28.8g ，Tris0.6g 加水定容至1000ml. 示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液。
四、实验步骤
1. 制胶：取一支长10cm 左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。
1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）：
将试剂按A:C:H2O:F=5ml：10ml ：5ml ：15ml 比例混合于一烧杯中. 用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆盖，在烘箱中25~35℃下聚合，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。
2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7
将试剂按，浓缩胶）： B:D:E:F=2ml：4ml ：2ml ：8ml 比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。
加入1厘米高左右，在小心地加入一层薄水。
25℃~35 ℃下放置，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去 然后胶管于烘箱中
表面水分。
2. 安装胶管
把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。
注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。
先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。
3. 加样
0.5ml 新鲜血清，用5ml20%蔗糖溴酚蓝溶液稀释（有老师配制） 。用微量注射器或移液枪向胶管内加20ul 样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。
4. 电泳
上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA 电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA 。
当示踪剂移至胶管下端
5. 剥胶
取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之1cm 处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。 间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。
6. 染色及洗脱
A. 将取下的胶条放入12.5%三氯醋酸中固定10min ，用1%考马斯亮蓝水溶液染色
7%三氯醋酸中固定10min ，用氨基黑10B 染色15min ，7%醋15min ，7%醋酸过夜保存。 B. 将取下的胶条放入
酸浸泡过夜。
注:染液回收
7. 观察绘图
将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。
注意事项
所有玻璃管和绿套头，在剥胶完毕后回收回讲台盒子中。
所有乳胶帽，在胶凝固后都回收回讲台的盒子中
所有针管和针头剥胶完成后回收回讲台
注意事项：
1.
2.
3.
4. 在电泳时所用凝胶试剂应选用高纯度试剂，否则会影响凝胶聚合和电泳效果。 样品中的盐浓度应尽量底，否则有拖尾现象。 最大加样量不超过100ug 蛋白/100ul 。 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时宜带
若电泳时间长，可以考虑在电泳槽下放冰降温。 手套和口罩。 5.
思考题
1、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应？
答：浓缩效应，
即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
分子筛效应，
聚丙烯酰胺凝胶是网状结构，会依据蛋白质的分子量的大小，蛋白质分子的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开
电荷效应
在浓缩胶中，被分离物的各组分被浓缩，特别是在浓缩胶与分离胶的分界处被高度浓缩，形成一个狭窄的高浓度区，但进入分离胶中，被分离物中各组分所带电荷不同，而有不同的迁移率，表面电荷多，迁移快，反之则慢。因此被分离物按照电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排列。
2、为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？
答：加入溴酚蓝的目的: 溴酚蓝呈蓝色，而蛋白质是白色，在凝胶中不明显。再则，溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分) 小，电泳时速度比蛋白质稍快，因此可用作指示。
加入蔗糖的目的: 跑胶前都会在Buffer(缓冲器) 里的，并要和样品充分混合，只是因为蔗糖比较重可以使样品沉到点样孔中，不会导致飘出来，从而可以最大限度地跑到胶里去，所以可以得到更好的结果。
3、上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？
答：不能混合存放，因为在电泳的过程中，缓冲液的成分含量发生了改变，上下
两槽的缓冲液已经不同，所以不能够混合存放。