一种新型的环境污染检测方法

第4期化 学 世 界

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一种新型的环境污染检测方法

朱文杰

(华东师范大学生命科学学院, 上海200062)

摘 要:在环境污染毒性监测方面, 作为生物监测法之一的发光细菌毒性检则法正越来越受到重视。简明介绍有关发光细菌的形态、生理、生态等, 重点阐明发光菌的应用原理、多种应用领域、在环境毒性检测方面的具体应用和毒性评价的方法, 同时对我国在这些方面的成果作了概括介绍。首次对海洋发光菌和淡水发光菌在应用方面的特点和差异作了分析。关键词:环境污染; 发光细菌; 毒性检测中图分类号:Q 935 文献标志码:A 文章编号:0367 6358(2009) 04 0247 04

A N ew M ethod of the Environm ental T ox icit y A ssay

ZH U Wen jie

(S chool of L if e S cience Ea st China N or mal Univ e rsity , Sh anghai 200062, China)

Abstract:As one of the bio logical assessment metho ds for m onitor ing o f env ir onm ental po llution, the assay using luminous bacteria has attracted increasing public attention. This paper br iefly describes the morpholog y, physio logy and ecolog y o f lum inescent bacter ia. The fundamentals o f application, the application fo r m onitoring environmental to xicity and so me ev aluation methods of toxicity are emphasized. Our countr y s achievements in assays using luminous bacter ia are introduced. T he characteristics and peculiarities of m arine luminescent bacteria and freshw ater lumino us bacter is are com pared. Key words:env ir onmental pollutio n; luminescent bacteria; to xicity assay

目前, 生态环境状况越来越受到关注, 而越来越多的化学合成物在改善人们生活的同时也带来对环境的危害, 进而影响我们的健康。对于环境中存在的那些有害物质, 必需有效、及时地进行监测。本文介绍一种新型的、有别于传统的监测方法 发光细菌法。

1 什么是发光细菌

夏天的夜晚萤火虫一明一暗的发光是人们最熟知的生物现象。这类非常奇特的能够发光的生物, 除了萤火虫之外, 在自然界中还有不少。小至细菌, 也有能发出可见光的种类, 而且已知的有十余种, 我们把这些天然存在, 能够发出可见光的细菌, 统称为! 发光细菌∀。

收稿日期:2008 10 28

当然由于发光细菌形体微小, 肉限根本看不见它们, 因此单个细菌所发出的光也极微弱, 肉眼当然也是看不见的。可是, 当发光细菌成千上万地生长

聚集在一起, 如果聚成一小点或一小片, 则就可以在黑暗的环境中看到这一小点或一小片绿荧荧的光。如果发光菌在某个物体表面长成一片, 则在黑暗中可以看到一片荧荧绿光。如果发光菌在某种水体里尘长繁殖, 则生长到一定的时期, 局部水体里的发光细菌达到一定的数量时就会使这个水体发出绿荧荧的荧光, 在黑暗的环境中清晰可辨, 其亮度有时甚至可以照亮周围的物体。海洋中就会有这种现象发生, 海水整个都变成绿色的发光体, 闪现着绿荧荧的波浪, 这就是所谓的! 海火∀。当然, 毕竟发光细菌所

作者简介:朱文杰(1939~) , 男, 教授。主要从事微生物生理学、自由基生物学的研究和教学。

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化 学 世 界 2009年

发光的亮度是很低的, 因此只有在黑暗的环境中才能看到它们的发光, 在白天光线较亮的地方是看不到它们发光的。

2 发光细菌的形态特征

发光细菌的形态:大多数发光菌为直的杆菌, 两端钝圆, 也有弯曲呈弧状的, 也有的杆菌较短, 呈球杆状。一般单个存在, 不聚集在一起。由于有鞭毛,

所以它们可以活泼地游动。有的发光菌仅有一根鞭毛(见图1) , 很象蝌蚪; 有的一端有数根鞭毛, 少数种类有周生鞭毛。

发光细菌的大小:不同种属的发光细菌大小略有差异, 且处于不同生长期的细胞大小也有不同。一般菌体长约1. 5~4 m, 宽约0. 5~0. 8 m

。

图1 发光细菌的形态:显示一种发光细菌 青海弧菌的菌体和其单生鞭毛(左:利夫森鞭毛染色, 相差显微镜观察∃1000 右:电子显微镜负染色照片∃15000)

3 发光细菌的种类和生态

海洋是发光细菌的主要栖息地, 绝大部分的发光细菌无论从数量或种类来看, 均是海洋性的, 仅少数是淡水型或陆地生存的。目前已经命名的发光细菌共有18种(species ) [1]。其中霍乱弧菌(Vibr io choler ea ) 和我国学者在青海湖唯一的一种无鳞鱼 裸鲤体表分离得到的青海弧菌(V. qinghaiensis ) [2]为淡水发光细菌, 光杆菌属(Photor habd us ) 则均为陆生发光细菌, 其余皆为海洋发光细菌。海洋发光细菌的最主要特征就是需要高渗透压、高盐度的环境以及对Na +的依赖:必需有一定浓度的Na +存在的外界条件下才能生长和发光, 否则就不能生长更不会正常发光。而淡水型或陆生型的发光细菌则不论有无Na +, 均能正常生长和发光。因此, 对高盐度(约3%) 和Na +的需要是海洋发光菌与非海洋发光菌的基本区分。

在自然状态中, 发光细菌有自由生存的, 也有附着于海洋生物如鱼、虾、乌贼、鱿鱼等身体上生存的, 更有生存在海洋生物的消化道内的, 这几种情形中发光菌是营腐生或寄生生活。还有不少发光菌是与其他海洋动物共生的。而且这些动物往往形成专门的发光器官, 其功能就是进行发光照明。已经知道, 发光菌与其共生的宿主往往是彼此互相适应的, 专一的。也就是说, 在某种动物体内共生的发光菌也只能是某一个种的发光菌, 其他种的发光菌是分离不到的。发光菌与其共生宿主的关系应该是互利共生:发光菌因宿主提供营养而在其中生存, 而宿主则致病菌, 例如哈维氏弧菌可致养殖的虾生病死亡, P hotor habdus asy mbiotica 是人的致病菌, 而发光光杆菌则寄生于线虫体内, 这些线虫可感染鳞翅目昆虫并致昆虫死亡。已知受感染的昆虫死亡是与发光细菌的存在有关, 有时这些昆虫尸体还会发光。4 发光细菌的发光原理

作为发光细菌最特别的生理代谢特征, 是在其生长的一定时间内, 能够发射可见光, 发光的原理与萤火虫的发光有点类似, 但并不相同。细菌发光可概括如下:细菌身体内可以合成一种酶, 称为细菌荧光酶, 它可以催化还原型的黄素单核苷酸发生氧化反应而放出光子, 这种氧化反应并不放热, 故而发光细菌在发光时并不伴随发热, 是典型的! 冷∀光。其光波范围是420~670nm, 最大发射波长为490nm, 故呈蓝绿色。其简略的反应方程式为:

F M N H 2+O 2+R CH O H 2O+h

细菌荧光酶

H +FM N +

上述反应式中FM NH 2为还原型黄素单核苷酸, O 2为氧分子, RCH O 为长链脂肪醛(8个C 原子以上) 。反应后的产物:RCOOH 为相应的长链脂肪酸, FM N 为黄素单核苷酸, h 表示发射的光子。细菌体内的长链脂肪醛为14个碳的醛。细菌荧光酶所催化的发光反应还涉及到细菌的有氧呼吸通路, 在功能上被认为是呼吸作用中电子转移到氧分子的一个代谢旁路。分子氧与还原型黄素单核苷酸生成中间物 荧光酶 黄素过氧化物, 该过氧化物的降解产生能量(约210kJ/mol) 足以生成单线态, [3]

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物发光的能量通常是来之于过氧化键的开裂, O O 键被两个更强的化学键所取代。

细菌的发光是细菌的生理代谢的一个组成部分, 而发光反应底物之一的FM NH 2是细菌呼吸作用的主要参与物, 与细菌的能量产生有直接关系, 因此, 一旦有任何外界条件不利于细菌的生理代谢, 就会立即反映为发光的代谢途径受到影响, 而导致发光反应受到抑制乃至猝灭。所以发光细菌的发光状况对外界条件的变化极为敏感, 例如, 发光细菌一旦接触到毒物, 吸收或吸附后只要能影响其生理代谢, 就会影响到它的发光强度, 通常是发光受到抑制, 且发光抑制的程度与所受毒物的浓度和毒性大小正相关。光强度的变化可以用测光仪方便地检测出来。这就是为什么可以利用发光细菌来检测环境中有毒、有害物质的基本依据。5 发光细菌的应用

发光细菌有广泛的应用价值。早在20世纪40年代, 就有关于利用发光细菌进行大气污染的监测, 抗生素的筛选, 麻醉药物的筛选等报道。对环境污染的监测, 近年来得到极大的重视及广泛的关注, 但目前所用的主要还是物理仪器及化学分析相结合的监测方法(如气相色谱, 质谱, 原子吸收光谱, 高压液相色谱等) 。这类方法的优点是能准确地定性定量, 但所需仪器设备往往价格昂贵、技术要求和使用成本很高, 即使不考虑这些, 仍有一个要害问题:这样的污染到底对人们的健康会有多大的危害? 尤其是中、远期的危害。显然, 上述检测是无法直接回答这个疑问的。如果有某一条河流受到污染, 或某种化学物质的突然的泄漏事故, 对污染来源及其主要成分可以用物理 化学的监测方法很快得到结果, 但要回答对流经区域周围的生物或人民群众的健康有什么影响, 也就是所谓对生物毒性的判断, 则上述监测也是无能为力的。要判断对健康的影响, 即对生物毒性大小的判断, 必须用生物医学的方法对污染的生物毒性进行分析判断。目前用得较多的检测污染物毒性的方法是从医学毒理学的方法引用过来的小鼠或是鱼类或是(枝角类动物) 、藻类等的毒性试验, 以受试生物的死亡数来判断毒性的大小, 一般需几天时间才能有结果。由于对受试生物有特别的要求, 进行操作也需要有专门的人员及专门的场地, 所以监测的成本较高, 还需要几天或几周的时间才能有结果, 不可能普遍推广应用, 而且, 若希望快速地作出结论, 则上述生物检测法是无法满足要求的。而应用发光细菌来检测污染物毒性则能克服这些缺陷[4]

说, 进行一次发光细菌对污染物或毒性物质的检测

实验, 仅需0. 25~1h 的就足够了。也就是说, 短时间内就可以告诉你受试验的物质有没有毒性及毒性有多大。大量的研究表明, 用发光细菌检测毒性的结果与鱼类或小鼠毒性检测的结果其一致性比较好。发光细菌很容易培养, 比起专门饲养小鼠、鱼类或是藻类等生物, 要方便得多, 成本也低得多。现在, 改进了的发光细菌检测方法是将发光细菌先期培养好, 制成冻干粉, 可以保存在-10%以下的冰箱中, 使用前仅需加入复苏液, 几分钟之后冻干粉恢复活力, 就可立即用于检测毒性物质, 就象用化学试剂那样简单、方便。目前已有商品的发光菌冻干粉供应市场, 这样一来, 检测者无需事先培养发光细菌, 也就无需配备细菌培养方面的设备及人员, 只要从市场! 拿来∀就可以进行检测试验了。这就更有利于在! 现场∀进行即时的监测或是抽检。而且, 由于发光细菌法试验每次所用的细菌数量达数百万, 因此个体差异可以忽略不计, 结果易于重复, 这也是其它生物方法所无法相比的。例如用鱼类或小鼠试验, 由于所用每条鱼或每只小鼠对毒物反应有个体差异, 因此为减小这种个体差异的影响, 就必须每次用大量的鱼或小鼠用于试验, 这不仅造成试验工作量的增加, 而且用成百上千的小鼠或鱼来用于一些普通样品的检测是不可能实施的, 因为成本耗费太大。由于个体差异不可避免, 这类实验重复也较困难。而用发光细菌来检测环境污染毒性, 不仅灵敏(据研究报道, 大约比一般鱼类毒性试验要灵敏几个数量级) , 且重复性好, 成本低廉而快速。其检测结果跟鱼类、小鼠毒性试验结果是吻合的。特别是快速:在0. 25~1h 内即可有结论, 这在某些紧急突发事件中, 例如毒物泄漏事故发生后, 能用发光菌快速作出判断, 以便快速及时地采取应急措施, 减少对环境的影响从而避免对周围人群造成不良的后果。例如这次5. 12四川大地震发生后, 对受灾地区的饮用水源的安全性判断, 就面临如何快速、正确地作出结论, 及时告知能否饮用的问题, 而国产的淡水发光细菌 青海弧菌检测法就发挥了良好的作用。至于海洋环境的保护, 海域污染的监测, 发光细菌使用起来也是非常方便的[5]。我国国家环保总局早在1995年就公布了发光菌检测毒性的方法标准(GB/T 15441 1995) , 由此各地环境监测部门用发光菌检测了很多河流水质的污染状况[6, 7]。

近年来由于环境污染而造成癌症发病率上升, 这是因为不少环境污染物具有致癌性, 人们接触之

本无法推断有无致癌的作用, 唯有用生物检测才能判断。而通常进行致癌试验的成本很高, 不可能大量地普遍地进行检测。但是如果用发光细菌来进行的话, 就会变得很简单, 成本相当低廉。其中一种方法是采用发光细菌的暗光突变种[8, 9], 另一种方法是用基因克隆的手段, 将发光菌的发光基因 lux 基因转入用来检测三致试验(致癌、致突变、致畸变) 的鼠伤寒沙门氏菌的细胞中去, 使该菌种也具有发光的能力, 这就可以用发光检测来取代原先十分麻烦的平板计数, 不仅操作变得简单, 而且时间由原先的48h 缩减到12h, 快速而且成本低[10]。

此外, 目前已开发或正在开发利用发光细菌来进行很多检测, 如食品卫生的快速检测

[11]

相对发光强度(%) =∃100%,

对照发光强度发光抑制率(%) =1-相对发光强度。

此外, 可以公认的毒物为标准, 用相对发光强度进行比对:我国1995年发布的水质毒性的发光细菌检测法国标(GB/T 15441 1995) 中就规定用H g Cl 2作为标准毒物, 在检测样品的同时, 也检测系列浓度的H gCl 2的相对发光强度, 制作标准曲线。以样品的相对发光强度从标准曲线上查得对应的H g Cl 2浓度, 则该样品的毒性大小即相当于该浓度的H gCl 2的毒性。用H gCl 2作为标准毒物的优点是, 它在医学毒理学研究中是被作为典型的细胞毒性物质的, 常用为毒物试验中的阳性对照物, 其生物细胞毒性作用既显著又稳定。笔者主张用苯酚作为标准毒物, 因为苯酚在医学上常用作为消毒杀菌剂, 且苯酚溶于水后往往有特殊的气味, 容易被察觉而引起人们的警惕, 苯酚比较容易被微生物分解为无毒性的物质, 并进一步被彻底氧化为CO 2和水, 因此不大会在环境中长期留存, 使用上比较安全。但苯酚的使用缺点是, 其晶体很容易吸潮, 称量困难。也有学者在其研究论文中提出用其它典型毒物作为毒性判断的标准毒物。其目的均是为了给出一个易让人理解的直观的毒性大小的比较和判断。也可以用EC50值来比较毒性大小:所谓EC50的概念是从医学毒理学的半数致死剂量引伸而来, 后者是指能使一组受试动物中的二分之一死亡的药物量, 相应的以发光强度的受抑制程度来计算, 就是能抑制50%的细菌发光强度, 也就是相对发光强度等于50%时该样品的浓度值。通常采用mg /L 或恰当的其它浓度单位(如质量百分浓度或体积百分浓度等) 来标示。显然, EC50值越小, 则毒性越大。这在客观上对各种不同的毒物的毒性大小可给出一个统一的比较和判断, 只要浓度单位相同就行。EC50值的应用比较广泛, 尤其从毒理学的角度来看, 比较客观、科学, 所以不仅科研论文中用得很多, 而且实际环境毒性评价中也是不可或缺的。有时, 再配以标准毒物的EC50值加以比较, 则更使人获得非常直觉和清晰的毒性大小的量化结论。参考文献:

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: )

; 科研中

用细菌发光基因作为报告基因用于基因克隆的实验[12, 13], 化学合成物及其降解物的毒性检测[14]等等。最近有利用发光菌分析有机合成化合物不同取代基团或不同部位取代基毒性大小与其结构的关系

[14]

。因此, 发光细菌在应用方面还大有潜力。海

+

洋发光细菌也有其固有的弱点:由于它们高度适应海洋的生态环境, 只有在盐度3%, 及丰富的N a 离子存在时才能良好生长和发光, 故检测淡水样品或其他样品时, 在待检样品中须另外添加NaCl 至终浓度为3%, 排除盐度对发光的影响。但20世纪80年代末, 就有研究者发现, 添加N aCl 达3%之后, 有的样品的毒性表现就明显地跟鱼类毒性试验不一致

[15, 16]

, 推测造成这种不一致的原因是由于额外添

加了太多的NaCl, 其Na +或Cl -离子均可能影响某些物质生物学毒性的表现。为了克服上述缺点, 有研究者寻求添加其他物质代替NaCl, 如采用葡萄糖、甘油等来取代NaCl 调节渗透压, 使样品溶液与海水等渗。但结果并不十分满意[17]。显然, 一定浓度的Na +的存在对海洋发光菌维持正常发光是必需的, 缺乏Na 就不能保证海洋发光菌的正常发光。因此, 采用生理上不需要NaCl 就能发光的淡水型或陆生的发光细菌就可以避开这一不足。我国青海省青海湖所产的青海弧菌是非致病的淡水发光菌, 其Q67菌株就显示了良好的特性

[2]

+

, 己被应用

于急性毒性检测的多个方面[18], 对淡水样品就不需要额外添加多量N aCl, 避免由此引起的对毒性判断的偏差。

6 发光菌检测毒性大小的判断方法

通常用相对发光强度及发光抑制率反映毒性大小:毒性越大则对发光抑制越厉害, 相对发光强度就

产品粒度分布具有显著影响, 为提高甘氨酸产品中40~80目的质量分率, 宜采用分段降温法, 搅拌速率取750~800r/min 。

2. 6 理想工艺条件下的重复性试验

对防结块处理的理想工艺条件进行了重复性试验, 结果如表5。

表5 理想工艺条件下的重复性试验结果

试验次数123

结块率/%0. 260. 250. 24

收率/%76. 976. 576. 7

40~80目质量分率/%68. 969. 468. 5

>80目质量分率/%18. 217. 718. 8

含量/%99. 1199. 1499. 13

原料配比120g 甘氨酸/210m L 水, 采用SDS 作防结块剂, 用量为甘氨酸质量的0. 7%, 搅拌速率750~800r/m in, 采用分段控制降温速率并于55%缓慢加入溶析剂乙醇25mL 。在该条件下进行防结块处理, 可使甘氨酸产品的抗结块性提高4. 7倍, 40~80目粒径的质量分率增至68. 9%, 甘氨酸含量符合食品级要求。本防结块处理技术成本低、无污染、简单实用, 为延缓食品级甘氨酸结块提供了依据, 对生产企业提高甘氨酸的防结块技术水平、提高产品质量将起到积极作用。参考文献:

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(略) 与甘氨酸的标准红外谱图完全一致[4]。3 结论

食品级甘氨酸防结块处理的理想工艺条件为:

(上接第250页)

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