棉籽蛋白肽生产工艺中水解度的几种检测方法探讨
棉籽蛋白肽生产工艺中水解度的几种检测方法探讨
一李贤永和保修
［北京中棉紫光生物科技有限公司，北京１０００４４］
前言
棉籽蛋白虽然以口感好、营养价值高著称，但由于蛋白的低水溶性和大分子量，限制了其乳化能力和发泡能力，从而阻碍了其在食品中的广泛应用。为此，国内外棉籽食品研究者从多方面对棉籽蛋白的分子结构进行改性以生产棉籽蛋白肽制品，其中以酶制剂水解较为常见。
酶水解就是采用蛋白酶或肽酶对棉籽蛋白的肽链进行全部或部分拆分，使其变成小分子量的肽类或氨基酸，从而在溶解性、吸水性、粘度、抗氧化性、乳化性、起泡性等诸多功能方面有明显的改善。
蛋白质被水解的程度（水解度）不同，获得的棉籽蛋白肽产品的功能也就不同，加之水解后产生的苦味物质（一些疏水性的短肽类）的多少往往也与水解度有关，故而为了获得特定功能的棉籽蛋白肽产品，水解度的动态检测及控制至关重要。
水解度（ＤｅｇｒｅｅｏｆＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ＤＨ）的测定方法通
表１
ａ为氨基的平均解离度，在具体的ｐＨ值和温度
．一ＨＩｐＫ
下可以计算出来，ｄ＝—旦面面（ｐＨ为水解溶液的ｐＨ
值，ｐＫ可近似取７．０）‘
ｋ为每一克纯棉籽蛋白所含肽键的毫摩尔数
（ｍｍｏＬ／ｇ）。
就大多数蛋白质而言，氨基酸的平均分子量为１２５，即１２ｓｇ／ｔｏｏｌ，则蛋白质的平均ｋ为１／１２５－－－０．００８
８ｍｍｏ［／ｇｏ
ｎｍｌ／ｇ＝
具体到棉籽蛋白，它的ｈ。可根据它的氨基酸含量经过计算得出。
下面以液一液一固脱酚棉籽蛋白为例，按表１进行具体计算：
１００９液一液一固脱酚棉籽蛋白样品中各种氨基酸含量
ｌ
２
３
常有ｐＨ一８ｔａｔ法、甲醛滴定法、ＴＣＡ法、ＯＰＡ法等。本
文介绍几种棉籽蛋白水解过程中水解度的测定方法，并对每种方法的特点及存在的问题加以分析。１．ｐＨ－－ｓｔａｔ法
１．１
原理
当蛋白质的酶水解过程在碱性条件下进行时，质子化的氨基酸将解离。因此，要保持反应体系的ｐＨ值不变，就必须补入碱液，碱液的消耗与水解的肽键数目成正比。１．２公式
ＤＨ％＝兰型掣×１００
ｒ
．Ｌ，
ｄ‘怫‘ｋ
其中：
Ｃ。１０。为酶解过程中所流加碱液的浓度（ｍｏｌ／Ｌ）；
ｖＮ柏。为酶解过程中所流加碱液的体积（Ｌ）；
Ｍｐ为酶解所加液一液一固脱酚棉籽蛋白的质量（ｇ）；
列ｌ是脱酚棉籽蛋白的蛋白含量及１８种氨基酸的含量。
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儡钐
列２是各种氨基酸的分子量。
列３为１００ｇ脱酚棉籽蛋白中各种氨基酸所含的肽键的毫摩尔数。
从最后一行的“总和”可以看到，５０．３４ｇ纯棉籽蛋白所含肽键的总毫摩尔数为３４３．７２
则ｈ。＝３４３．７２ｍｍｏＶ５０．３４２甲醛滴定法２．１原理
蛋白质水解液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上
ｍｍｏｌ，
５每种测定方法的特点及存在的问题
５．１
ｐＨ—ｓｔａｔ法
因为酶解体系的ｐＨ值始终控制在酶制剂所要
求的最适合的ｐＨ值，所以要求精确补碱，精确计量酶解伊始的补碱体积。其中的ａ和ｈ。。虽说在温度、ｐＨ值、原料等稳定的情况下均为常数，但在上述条件发生变化时要及时修正，以确保结果相对准确。５．２甲醛滴定法
因其简便快速，较为常用，但存在以下几个问题。ａ．脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
ｂ．由于氨的存在，滴定得出的结果包括氨基氮
ｇ＝６．８３ｍｍｏＬ／ｇ。
的一Ｎ＋Ｈ３结合，形成一ＮＨ—ＣＨ２０Ｈ、一Ｎ（ＣＨ２－旬Ｈ）２
等羟甲基衍生物，使Ｎ＋Ｈ，上的Ｈ＋游离出来，这样就可以用碱滴定Ｎ＋Ｈ，放出的Ｈ＋。也就是说，用甲醛屏蔽氨基，再用碱滴定羧基，从而根据消耗的碱量箅出氨基酸的含量。２．２公式
（假定酶解配料的棉籽蛋白与水的比例为ｍ：ｖ）
和氨氮两部分。氨氮可以测定并修正或去除。磷酸盐
也影响结果，而必须用钡盐去除。多肽和其它复合蛋白质衍生物在一定程度上与甲醛发生反应，因此，所产生的结果并不十分准确。
ｃ．有弱酸（如一些脂肪酸）存在时，也会影响结果，导致其数值偏高。５Ｊ３三氯乙酸（ＴＣＡ）法
要求精确计量酸溶后“上清液”的体积。但有时“上清液”上层会有一层“薄膜”，导致清液不清，或者“沉淀”不实，影响“上清液”和“沉淀”的分离，这些都会影响“上清液”的计量，从而影响最后结果。５．４邻苯二甲醛（０ＰＡ）法
该方法要求ＯＰＡ试剂需当日配制使用，加之计算公式中涉及到的与蛋白种类相关的两个参数Ⅱ、Ｂ的意义尚不清楚，又没有棉籽蛋白的相关经验数值，暂未应用。现在已知，该方法计算公式中涉及到的ｌｌ娃
朋纽盟篙品等竺删
其中：
Ｖ，为ｌＩｎｌ水解液消耗的ＮａＯＨ溶液体积（ｍ１）；ｕ为ｌｎ１１空白液消耗的ＮａＯＨ溶液体积（ｍ１）；Ｖ为配料用水体积（ｍ１）；
Ｃ为滴定用ＮａｏＨ溶液浓度（ｍｏｌ／Ｌ）；
Ｍ为配料所加液一液一固脱酚棉籽蛋白的质量（ｇ）；ｐｒｏ为配料所加液一液一固脱酚棉籽蛋白的蛋白含量（％）。
３三氯乙酸（ＴＣＡ）法
３．１
原理
三氯乙酸为强酸，是极好的蛋白沉淀剂，能够除去大分子的蛋白质。在酶解液中加入，Ｉ℃Ａ溶液，混合
与ｐＨ—ｓｔａｔ法中的概念一致，可以借鉴。
棉籽蛋白酶解生产的小分子具有极强的生物活性和多样性的棉籽蛋白肽，可以进一步提高棉籽的附加值，延长棉花产业链，已在世界范围内引起关注，成为当今追捧的热点。
酶解使原来蛋白质的功能特性发生了很大变化，这些特性的改变很大程度上取决于水解度的大小。严格控制水解度，选择在合适的时机中止酶解反应，才能获得具有不同分子量大小、不同溶解性等功能特性的产品，同时又可以避免肽链的过度失控水解形成苦味物质。
所以，水解度的检测及控制具有十分重要的现实意义，应当予以足够的重视。☆
振荡后高速离心，使未水解的大分子蛋白质沉淀，而
与小分子的酸溶蛋白成分（上清液内），即肽类和游离氨基酸分开，测定酸溶蛋白占总蛋白（凯氏定氮法）的含量，求得水解度，即酸溶蛋白占总蛋白的百分比。３．２公式
删％＝甓碧×１００
４邻苯二甲醛（ＯＰＡ）法
４．１原理
每水解一个肽键便会释放出一个游离胺基。游离胺基与ＯＰＡ（邻苯二甲醛）反应形成一种黄色络合物，可用分光光度计测量其吸光度。
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棉籽蛋白肽生产工艺中水解度的几种检测方法探讨
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
李贤永， 和保修
北京中棉紫光生物科技有限公司,北京,100044中国棉花加工
CHINA COTTON PROCESSING2008(4)
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