微生物学 实验三 平板菌落计数法
实验三 平板菌落计数
一、目的要求
学习 菌种的 平板菌落计数的基本原理和方法。
二、基本原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液接种到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是,由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞,所以,长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低,为了清楚地阐述平板菌落计数的结果,现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units,cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁,结果需要培养一段时间才能取得,而且测定结果易受多种因素的影响,但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息,所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂),以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。
三、器材
1 . 菌种:大肠杆菌菌悬液。
2 . 培养基:LB 培养基。
3 . 仪器或其他用具: 1ml 无菌吸管,无菌平皿,盛有 4.5ml 无菌水的试管,试管架,恒温培养箱等。
四、操作步骤
1 . 编号
取无菌平皿 9 套,分别用记号笔标明 10 、 10 、 10 (稀释度)各 3 套,另
-1-2-3-4-5取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管,依次标是 10 、 10 、 10 、 10 、 10 、
10 。
2 . 稀释
用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液(待测样品),精确地放
-10.5ml 至 10 的试管中,此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。 -6-4-5-6
将 10 试管置试管振荡器上振荡,使菌液充分混匀。另取一支 1ml 吸管插入 10 试管中来回吹吸菌悬液三次,进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快,吸时吸管伸入管底,吹时离开液面,以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸
-1-2管吸取 10 菌液 1ml ,精确地放 0.5ml 至 10 试管中,此即为 100 倍稀
释。······其余依次类推。
放菌液时吸管不要碰到液面,即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液,否则稀释不精确,结果误差较大。
3 . 倒平板法:1)取样。用三支 1ml 无菌吸管分别吸取 10 、10 和 10 的稀释菌悬液各 1ml ,对号放入编好号的无菌平皿中,每个平皿放 0.2ml 。 不要用 1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2ml 稀释菌液放入平皿中,这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。 2) 倒平板。尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至 45 ℃左右的LB 培养基约 15 毫升 / 平皿,置水平位置迅速旋动平皿,使培养基与菌液混合均匀,而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面,所以菌液加入到培养皿后,应尽快倒入融化并已冷却至 45 ℃左右的培养基,立即摇匀,否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起,影响计数。 3)待培养基凝固后,将平板倒置于 37 ℃恒温培养基中培养。
4. 涂布法:涂抹平板计数法与倒平板法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1ml 菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀(图22-
3),每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min ,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至长出菌落后即可计数。
5 . 计数
培养 48h 后,取出培养平板,算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数,并按下列公式进行计算:
每毫升中菌落形成单位( cfu ) = 同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数× 5
一般选择每个平板上长有 30~300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适,同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大,否则表示试验不精确。实际工作中同一
-4-5 稀释度重复三个对照平板不能少于三个,这样便于数据统计,减少误差。由 10 、 10
-6和 10 三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很重要的,一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后,所出现的平均菌落数在 50 个左右为好,否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
五、实验结果 -4-5-6-1-1
将培养后菌落计数结果填入下表:
六、 思考题
( 1 )为什么融化后的培养基要冷却至 45 ℃左右才能倒平板?
( 2 )要使平板菌落计数准确,需要掌握哪几个关键?为什么?
( 3 )试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
( 4 )当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时,你认为问题出在哪里?
( 5 )用倒平板法和涂布法计数,其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间( 48h )后观察结果?