人体生物等效性试验中生物样本分析技术的评价

人体生物等效性试验中生物样本分析技术的评价

CDE审评五部 吴丽花 杨焕

摘要: 笔者通过仔细分析和梳理在人体生物等效性试验审评中发现的生物样本分析方面的问题,对《化学制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》进行再次解读，期望对进一步提高人体生物等效性试验水平有所帮助。

一个完整的生物等效性研究包括试验设计、生物样本分析、统计分析和结果评价四方面的内容。建立可靠的和可重现的定量分析方法是进行生物等效性试验的关键和基础。2005年SFDA发布的《化学制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》中明确地描述了测定方法建立和确证、质量控制的基本要求，此类试验一般都应按照该指导原则来进行。然而，在审评过程中发现部分申请人提供的生物样本分析资料简单且粗糙，严重影响了对生物等效性试验结果的整体正确评价。本文仅就生物样本分析技术评价中的常见问题逐一梳理，以供交流。

1．特异性：须提供色谱条件、质谱条件、质谱扫描图。应该完整提供：（1）空白生物样品色谱图：至少要考察6个不同个体，空白生物样品中干扰物质的响应不超过待测物定量下限时响应的20%（S/N=5）；（2）对照物质色谱图（注明浓度）：受试药品的原形药物或特定活性代谢物、内标；

（3）空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）；（4）用药后的生物样品色谱图；（5）对于质谱分析，应注意考察分析过程中的基质效应（ME，将另文详述）。

2.标准曲线和定量范围：反映浓度与仪器响应值（峰高、峰面积）之间的关系，应提供线性方程和相关系数。需注意：（1）采用与分析样本相同的生物介质（血清、血浆、全血、尿等）；（2）必须至少用6个浓度点；（3）随行空白生物样品（计算时不包括该点，仅用于评价干扰）；（4）定量范围要能覆盖全部待测生物样品浓度，不得外推。有文献资料认为上限可为最高浓度的115%，下限可为最低浓度的80%。

多数申请人在项目上基本都能提供上述资料，但审评也发现，尽管试验报告均提供了线性方程和相关系数，大多数也提供了相应浓度的响应值，但是往往都忽视了对合格标准曲线的判定。事实上，指导原则中清楚地阐述只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算。合格标准曲线的判定标准应包括：（1）相关系数r > 0.99；（2）实测值与标示值的偏差（相对标准差，RSD，精密度）最低浓度点小于20%，其他小于15%。需要指出的是，仅相关系数r > 0.99并不能保证实测值与标示值的偏差在可接受的范围之内。

3．定量下限(LLOQ)：LLOQ是标准曲线上的最低浓度点，需符合下列要求：（1）应能满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10～1/20的药物浓度；（2）其响应值应为空白生物基质干扰物响应值的5倍以上（S/N≥5）；（3）准确度应在真实浓度的80%～120%范围内；精密度为RSD小于20%；（4）至少应有5个标准样品测试结果证明。

审评发现，多数试验报告对LLOQ的描述是一笔带过，未对其准确度和精密度等指标进行判定，有时把LLOQ和最低检测限混淆。提醒注意的是，由于定量的需要，LLOQ的响应值测定时至少要保证S/N在5，而最低检测限（灵敏度，S/N＝3）只需能检到该物质即可，但不能保证定量的准确性。尽管在后续的精密度和准确度等考察时，低浓度的质控样品通常也会选定在LLOQ，但建议在制作标准曲线时，随行制作5个定量下限样本，从而获得定量下限的准确度和精密度结果。

4. 精密度和准确度：用低、中、高3个浓度的质控样品来考察，需关注：（1）低浓度的选择应在定量下限3倍以内（大多会选定LLOQ），高浓度应接近标准曲线的上限；（2）准确度：实测

浓度与真实浓度（标示值）的接近程度，用相对回收率来表示，一般中、高浓度应在85％～115％范围内，在LLOQ附近（低浓度）应在80％～120％范围内；（3）精密度：相同浓度样品测量值的分散程度（偏差），用批内和批间相对标准差(RSD）来考察，一般（中、高浓度）RSD应小于15％，在LLOQ附近（低浓度）RSD应小于20％；（4）测定批内精密度，每一浓度至少制备并测定5个样品；测定批间精密度，应在不同天连续制备并测定，至少有连续3个分析批（不少于45个样品）。 质控样品的低浓度选择LLOQ未尝不可，倘若对于LLOQ已经进行了考察，则最好选择其它浓度，但注意应在LLOQ 的3倍以内。对于高浓度质控样品，可选择上限值或上限值的75～90%，推荐选择接近Cmax的浓度（参照文献报道或预试验的Cmax值）。在绝大多数提供的注册资料中，质控样品浓度的选择通常是符合要求的，但往往没有充分理解批间精密度的具体要求，或同批内精密度一样提供每一浓度的5个数据，或仅提供每一浓度的3 个数据。故需注意在测定批间精密度时至少应有连续3个分析批，不少于45个样品的测定值。还有的资料以待测样品分析时进行方法学质量控制中的批内、批间精密度来代替方法学确证中的批内、批间精密度，这是非常不妥的做法。应该强调的是，在方法学尚未确证之前是无法进行生物样品的定量分析测定的。

5. 样本稳定性：建议根据具体情况，并参照文献中关于分析物稳定性的报道，在结合各试验环节，考察以下三类样本的稳定性，即（1）含药生物样品处理和储存过程中的稳定性（室温/冷藏/避光/冰冻/冻融条件下）；（2）样品处理后分析物在溶液中（上样液）的稳定性（室温/冷藏）；

（3）储备液（包括对照品和内标溶液）的稳定性。

审评中发现该部分资料缺项十分常见，尤其是处理后的待测样品（上样液）以及储备液的稳定性试验资料往往缺如。建议各临床试验研究单位尽可能规范地进行稳定性考察，以保证生物样本分析结果的准确性和重现性。

例如，某药物提供的药动学数据：静脉滴注75mg后Cmax 12.24±2.22 mg/L、AUC 28.98±2.76 mg·h/L，而国外参考文献数据为口服后吸收迅速，生物利用度90～100%，口服75mg后Cmax最高约0.5mg/L，AUC约2.4 mg·h/L，两者进行对比分析，相差甚远，经申报单位深入分析试验过程，发现提供的对照品在运输过程中极不稳定，而在试验中又未进行稳定性考察，在分析方法学确证上存在较大问题，故改进方法重新进行了该品种的药代动力学研究。

6.提取回收率（绝对回收率）：指样品提取过程前、后分析物的含量百分比。需注意（1）扣除基质效应和体积改变；（2）应考察低、中、高3个浓度的提取回收率；（3）其结果应当精密和可重现。对于提取回收率要求的并不是其绝对值的高低，能达到检测的灵敏度即可，通常在50%以上。但强调其结果应精密和可重现，这里包含值得商榷的两层意思：（1）低、中、高3个浓度各自的提取回收率的精密度要好，可以认为要求RSD小于15%；（2）低、中、高3个浓度之间的提取回收率也应相差不大，可以认为总体RSD小于15%。申报资料对于提取回收率方法的描述不尽相同，此方面问题将另文讨论和分析。

7. 测定方法的质量控制：检测生物样本时，应确保（1）每个分析批应随行建立新的标准曲线；

（2）每个分析批应随行测定至少各双样本的高、中、低三个浓度的质控样品，并均匀分布在未知样品测试的顺序中；（3）质控样品数应不少于未知样品总数的5%；（4）质控样品测定结果的偏差（RSD）一般在中、高浓度应小于15％，低浓度应小于20％；（5）最多允许1/3 的质控样品结果超限，但不能出现在同一浓度中。

申报资料往往会提到在生物样本测试时遵守随行质量控制的SOP，却没有提供方法学质量控制的具体情况，难以认可生物样本检测数据的准确、可靠和可重现性；有的资料尽管提供了方法学质

量控制的情况，但在描述上过于简单，多以质控样品测定的总体均值和标准差来表示，无法了解每个质控样品结果超限的情况，应建议提供各质控样品的具体测定值和RSD，从而可以判定所采用测定方法的质量控制情况。还应提醒注意质控样品数应不少于未知样品总数的5%。

此外，不论是生物等效性研究还是人体药代动力学研究，指导原则必须要求申报单位提供20%受试者样品测试（包括随行标准曲线及质控）的色谱图复印件。仅从单个岗位目前申报的资料分析，至今仍有近一半的资料中（56/118）没有提供色谱图，而有的资料尽管提供了20%受试者样品测试的色谱图，但未提供随行标准曲线及质控的色谱图。从生物等效性研究的整体评价来看，方法学的确证和质量控制无疑是关键的，而提供的临床试验报告缺条少项，无法保证数据的真实性和可靠性，此时通过所提供的色谱图有助于判断生物样本检测的质量。为提高对5、6类化药技术审评的质量和效率，提醒注册申请人、临床试验单位规范生物样本分析过程，并提供准确、可靠的数据及相关色谱图资料。