碱裂解法提取质粒
碱裂解法抽提质粒原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术,以下碱裂解法制备质粒的原理。碱法质粒抽提用到三种溶液,溶液I:50 mM葡萄糖、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA,pH 8.0;溶液II:0.2 N NaOH、1% SDS;溶液III :3 M 醋酸钾、 2 M 醋酸。
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,可以抑制 DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀,不能有结块,否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。SDS也呈碱性,但如果只用SDS,达不到彻底溶解细胞的作用,加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用 SDS在高盐浓度下发生沉淀,同时SDS能与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS,高浓度的盐使沉淀更完全。同时,由于基因组DNA很长,容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂,小于100 kb的片断,就不容易与 PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置,可以使PDS沉淀更充分。
4、酚/氯仿/异戊醇的作用 PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀,酚可以使蛋白质变性,作用大于氯仿,但水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液,离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收。还有,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。异戊醇的添加,主要可以使离心后上下层的界面更加清晰,方便水相的回收。
质粒提取与纯化试剂配制
1、 溶液I:50 mM葡萄糖、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA,pH 8.0;高压灭菌15min后4℃保存
2、 溶液II:0.2 N NaOH、1% SDS;或10N NaOH 2ml , 10%SDS10ml ,H2O 88ml
3、 溶液III :5mol/L 醋酸钾 60ml、 醋酸 11.5ml H2O 28.5ml 配制成100ml裂解液III 4℃保存,用前冰浴,K为3mol/L,AC为5mol/L
4、 STE 菌液体积的0.25倍
10mM Tris-Cl pH 8.0,0.1mM NaCl , 1mM EDTA 高压灭菌20min 4℃保存,用前制冷
5、 乙醇 70%
6、 溶菌酶 10mg/ml 使用前用100mM Tris-Cl 即刻溶解溶菌酶,配制成10mg/ml贮存液,PH一定不能低于8.0 否则溶酶菌失效。
7、 LiCl (5mM)
8、 NaAC (3Mm) PH5.2
408.3g+800mL水 冰乙酸 调PH5.0——用水定至1L,分装后高压灭菌
9、PEG-MgCl2 PEG :40%(mv) 30mM MgCl2
40gPEG + 水溶解至100ML——0.22过滤,室温保存
10、TE1 PH8.0
TE2 PH8.0 含20ug/Ml RnaseA
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备可采用碱裂解法
(一)细菌的收获和裂解
1.收获
1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中,然后接入一单菌落,于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于4℃以12000g离心3
0秒,将剩余的培养物贮存于4℃。
3)吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离细菌沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。 2.碱裂解法
1)将细菌沉淀,所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。 溶液I:
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制,每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散,将两个微量离心管的管底部互相接触震荡,可使沉淀迅速分散。
2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS
盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡,将离心管放置于冰上。
3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口,将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3-5分钟。
4)用微量离心机于4℃12 000g离心5分种,将上清转移到另一离心管中。 5)可做可不做:加等量酚:氯仿, 振荡混匀, 用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟,将上清转移到另一离心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提,然而由于一些未知的原因,省略这一步,往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合, 于室温放置2分钟。 7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。
8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽量使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀,按步骤8)所术方法去掉上清,在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i. 此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC),其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg。
ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA,可取1μl DNA溶液加到另一含8
μl水的微量离心管内,加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶, 在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。
iii. 此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:
质粒DNA的大量制备
(一)在丰富培养基中扩增质粒
许多年来,一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效,然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中,采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA,而且重复性也很好。
1)将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素,用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。
2)将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37℃)施放入25ml对数晚期的培养物,于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分),所得培养物的OD 600值约为0.4。
3)可做可不做:加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇),使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒,有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复制达到很高的拷贝数,因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理,具有抑制细菌复制的优点,可减少细菌裂解物的体积和粘稠度,极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来,尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便,但用氯霉素处理还是利大于弊。 4)于37℃剧烈振摇(300转/分),继续培养12-16小时。
(二)细菌的收获和裂解
1.收获
1)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
2)按步骤1)所述方法离心,以收集细菌细胞。
2,碱裂解法
1)将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml(18ml)溶液I中。
溶液I:
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制,在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。
2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时,溶菌酶不能有效工作。
3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ:
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS
盖紧瓶盖,缓缓颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。 4)加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ:
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。
封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟,应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。
5)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧,可以5000转/分再度离心20分钟, 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4)]。
6)上清过滤至一250ml离心瓶中,加0.6体积的异丙醇,充分混匀,于室温放置10分钟。
7)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟,回收核酸。如于4℃离心,盐也会了生沉淀。
8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇,用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴,于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10)纯化。
四、质粒DNA的纯化
聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA
氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA
(一)聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1)将核酸溶液所得]转入15mlCorex 管中, 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇, 充分混匀, 用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏, 回收沉淀的核酸。
3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
8)吸去上清,加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD 260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml), 然后将DNA贮于-20℃。