冻干保加利亚乳杆菌增菌培养基的筛选

82 2004, Vol. 25, No. 7

食品科学※基础研究

冻干保加利亚乳杆菌增菌培养基的筛选

余　华１，颜　军１，刘海燕２，张　威３，郭平莎１

（１．成都大学生物工程系，四川　成都　　　　　　６１０１０６；２．成都华西乳业集团，四川　成都　　　　　　６１００４１；

３．四川省质检所，四川　成都　　　　　　　６１００３１）

摘　　　要：本文采用正交实验对冻干保加利亚乳杆菌的增菌培养基进行了筛选，研究了保加利亚乳杆菌在增菌培养基中的活菌数及菌活力，以寻找冻干保加利亚乳杆菌发酵的最适收获期。结果表明：冻干保加利亚乳杆菌的增菌培养基为：ＭＲＳ基础培养基、麦芽汁体积分数为１０％、番茄汁体积分数１０％、ＣａＣＯ３的质量分数为０．０５％、乳糖的质量分数为１．０％。保加利亚乳杆菌的最适收获期为发酵１８ｈ，此时为对数生长期后期，活菌数为３．９６×１０１１ｃｆｕ／ｇ，ＯＤ值为０．９２２，菌活力为５００Ｔ、ｐＨ４．４６。增菌培养基增菌效果明显，经增菌培养基培养所得活菌数是基础培养基的２０２倍，　且菌活力也较基础培养基强，ＯＤ值和滴定酸度分别是基础培养基的５．６倍和１．３倍。关键词：保加利亚乳杆菌；增菌培养基；活菌数；菌活力

Ｓｉｅｖｉｎｇ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｏｐｔｉｍｕｍ　Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　　Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ

ＹＵ　Ｈｕａ１，ＹＡＮ　Ｊｕｎ１，ＬＩＵ　Ｈａｉ－ｙａｎ２，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ３，ＧＵＯ　Ｐｉｎｇ－ｓｈａ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｃｈｅｎｇｄｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｃｈｅｎｇｄｕ　　　　６１０１０６，　Ｃｈｉｎａ；

２．Ｃｈｅｎｇｄｕ　Ｈｕａｘｉ　Ｄｉａｒｙ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｃｈｅｎｇｄｕ　　　　　６１００４１，　Ｃｈｉｎａ；

３．Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｃｈｅｎｇｄｕ　　　　６１００３１，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ　ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ｗａｓ　ｓｉｅｖｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ　ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ｗｅｒｅ：　ＭＲＳ，　ｗｈｅａｔｍａｌｔ　ｊｕｉｃｅ　１０％，　ｔｏｍａｔｏ　ｊｕｉｃｅ　１０％，　ＣａＣＯ３　０．０５％　ａｎｄ　ｌａｃｔｏｓｅ　１．０％．Ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｈａｄ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ．　Ｔｈｅ　ｖｉａｂｌｅｃｅｌｌｓ　ｎｕｍｂｅｒ　ｒｅａｃｈｅｄ　３．９６×１０１１ｃｆｕ／ｇ，　ＯＤ　０．９２２，　ａｃｔｉｖｉｔｙ　５００Ｔ　ａｎｄ　ｐＨ４．４６．　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｆｕｎｇｕｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ　１８ｈ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ；ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｔｈｅ　ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｎｕｍｂｅｒ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ

中图分类号：ＴＳ２０１．２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００４）０７－００８２－０４

发酵剂是决定酸奶品质的一个关键因素，国内多数酸奶生产企业采用传统的液体发酵剂。液体发酵剂存在

收稿日期：２００３－０８－１１

作者简介：余华（１９６７－），女，副教授，硕士，从事功能　　　　　　　　　　　　　　　　　　　性食品的研究。［８］［９］

刘慧，　冯一兵．　酸奶生产的菌种保藏，活化及其扩培技术［Ｊ］．食品工业，　１９９６，　（１）：２１－２２．

Ｒｅｇｉｎａｌｄ　Ｗ　Ｂｅｎｎｅｔ，Ｇａｙｌｅ　Ａ　Ｌａｎｃｅｔｔｅ．Ｃｈａｐｔｅｒ　１２．Ｓｔａｐｈｙｌｏ－ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ［Ｊ］．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ　Ｏｎｌｉｎｅ（ＦＤＡ－ＣＦＳＡＮ），２００１，（１）．

［１０］陈道利，　高岭．　凝固酶及核酸酶试验综合评价金黄色葡萄

菌种扩大培养操作繁琐、周期长；菌种易污染、退化、

变异；发酵剂活菌含量低（１０７～１０８／ｍｌ）；生产接种量较大［３］等众多弊端。直投式冻干发酵剂是酸奶发酵剂的发展方向。近两年来已有一些有实力、经营意识强的酸奶厂家为了提高产品质量，不惜重金从国外购买ＤＶＳ，减少发酵剂繁杂工序和传代复壮次数，防止菌种变异及

球菌致病力的实验研究［Ｊ］．中国卫生检验杂志，　２００１，（３）．［１１］蒋碧卿．　食物中金黄色葡萄球菌肠毒素检测法－耐热核酸

酶的测定［Ｊ］．　科技交流学会月刊，　１９９９，１０：４９－５０．［１２］Ｓ　Ｒ　Ｔａｔｉｎｉ．Ｔｈｅｒｍｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　ｏｆ　ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ

ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ　ｉｎ　ｆｏｏｄｓ［Ｍ］．Ａｎｔｉｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｔｏｘｉ－ｃａｎｔｓ　ｉｎ　Ｆｏｏｄ，１９８１．５３－５７．

※基础研究食品科学

１．３．１．１

平板计数法

2004, Vol. 25, No. 783

噬菌体污染［２］。但菌种在冻干过程中会造成细胞损伤或死亡以及酶蛋白分子钝化，从而降低活菌数及菌活力［３］

。欲得到高活菌数且活力高的酸奶发酵剂冻干菌种，首先必须筛选出适合乳酸菌生长的增菌培养基，使乳酸菌得以大量增殖［６］。其次必须筛选出适合乳酸菌冻干的保护剂，以减少菌种干燥致死数量［２］。增菌培养基的选择基于价格低，细胞产率高、存活率高，易收获和保持混合菌菌相平衡条件［２］。作者分别对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的增菌培养基及冻干保护剂进行了较详细研究。乳酸菌发酵剂的制备需要良好的增菌培养剂，使乳酸菌得以大量增值，从而使乳酸菌在经过喷雾干燥、冷冻、冻干等处理后有足够的活菌数残存［４］。增菌培养基能使乳酸菌大量繁殖，得到很高的活菌数，从而使其在经过冻干处理后有足够的活菌数残存［２］。

本文研究的是酸奶生产菌种——保加利亚乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）的增菌培养基。根据保加利亚乳杆菌的营养需求，以ＭＲＳ为基础培养基，加以乳糖、生长促进剂和ｐＨ控制剂等物质，通过正交实验和极差分析筛选其最适增菌培养基。并研究菌种在增菌培养基下的生长状况，探讨其活菌数和菌活力，寻求冻干菌种发酵最适收获期。１１．１

材料与方法材料

ＭＲＳ液体培养基　　　　蛋白胨１０ｇ、肉膏１０ｇ、酵母膏５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　２ｇ、醋酸钠５ｇ、柠檬酸铵２ｇ、葡萄糖２０ｇ、吐温８０　１ｍｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２５ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　０．５８ｇ、蒸馏水１０００ｍｌ。

ＭＲＳ固体培养基　　　　蛋白胨１０ｇ、肉膏１０ｇ、酵母膏５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　２ｇ、醋酸钠５ｇ、柠檬酸铵２ｇ、葡萄糖２０ｇ、吐温８０　１ｍｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２５ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　０．５８ｇ、琼脂１８ｇ、蒸馏水１０００ｍｌ。

麦芽汁（浓度为１２％）；由成都啤酒厂提供。保加利亚乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）　　　　　由成都华西乳业集团提供；０．９％无菌生理盐水、０．５％酚酞指示剂、０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ标准溶液、ｐＨ６．４磷酸盐缓冲溶液等。１．２

设备及器具

ＳＷ－ＣＴ－ＩＢ超净工作台、ＤＢ２ＬＯＳＬ鼓风干燥箱、ＬＤＺ４－０．８离心机、５７２紫外可见分光光度计、ｐＨ－５２２精密计、ＷＨ－３微型旋涡混合仪、ＥＲ－１８０Ａ电子分子天平、ＨＺＱ－Ｆ１６１０全温振荡培养箱、ＨＺＱ－Ｃ空气浴振荡培养箱，ＹＸ２８０Ｃ手提式蒸汽消毒器等。１．３１．３．１

方法

乳酸菌活菌数的评价

取１ｍｌ培养了一定时间的增菌、基础培养液菌液，

在无菌操作下用０．９％的生理盐水按１０－６～１０－９稀释度稀释后，分别倒入约５０℃的ＭＲＳ固体培养基中，在３７℃恒温培养２４ｈ后，进行菌落计数。每个稀释度做两个平板（以平均数计）。

１．３．１．２比浊法（光密度法）

每隔一段时间分别取８ｍｌ基础、增菌培养菌液，冰浴２０ｍｉｎ，经４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ后，取上清液进行滴定酸度的测定。将离心出的菌体用２２ｍｌ　ｐＨ６．４磷酸盐缓冲溶液复悬，用紫外可见分光光度计测ＯＤ６００值。１．３．２

乳酸菌活力的评价　　　　用乳酸菌的产酸性来衡量（滴

定酸度和　ｐＨ值表示）。

１．３．２．１乳酸菌滴定酸度的测定

取１．３．１．２离心后待用的上清液５ｍｌ入三角瓶中，用４５ｍｌ蒸馏水稀释，加２滴酚酞，混匀后用０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ标准溶液滴定至出现粉红色，并且３０ｓ内不褪色即为滴定终点。将滴定所消耗的ＮａＯＨ标准溶液的量乘以１０即为滴定酸度，用°Ｔ表示。１．３．２．２２２．１

ｐＨ值的测定　　　　用ｐＨ５２２精密计测定。

结果分析

保加利亚乳杆菌增菌培养基的筛选

本实验用Ｌ９（３４）正交实验筛选保加利亚乳杆菌增菌培养基，以麦芽汁、番茄汁、乳糖、ＣａＣＯ３四个营养成分作为正交实验的因子，其中麦芽汁提供菌体生长所需要的氮源，乳糖提供碳源，西红柿汁提供维生素、核苷酸等营养素源［２］，ＣａＣＯ３作为中和剂缓冲发酵旺盛时所产生的大量乳酸。其因子水平及结果分别见表１～４。

表１　　　　　　　保加利亚乳杆菌增菌培养基的因子水平水平ⅠⅡⅢ

Ａ　番茄汁（％）０５１０

Ｂ　麦芽汁（％）０５１０

Ｃ　ＣａＣＯ３

（％）００．０５０．１

Ｄ　乳糖（％）００．５１．０

由表２可知，以ｐＨ为实验结果时，影响增菌培养基的因子顺序为Ｃ＞Ａ＞Ｄ＞Ｂ，其最佳组合为Ａ３Ｂ３Ｃ２Ｄ２；由表３可知，以ＯＤ６００为实验结果时，影响增菌培养基的因子顺序为Ｃ＞Ａ＞Ｂ＞Ｄ，其最佳组合为Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３；由表４可知，以°Ｔ为实验结果时，影响增菌培养基的因子顺序为Ｃ＞Ａ＞Ｂ＞Ｄ　，其最佳组合为Ａ３Ｂ２Ｃ２Ｄ３。

表２　　　　　　　保加利亚乳杆菌增菌培养基的筛选（以ｐＨ为结果）试验序号

１２３４５

６７８９Ｋ１Ｋ２Ｋ３Ｐ１Ｐ２Ｐ３Ｒ

Ａ１２１２２２３３３１５．３９１５．２２１５．０２５．１３５．０７５．０１０．１２

Ｂ１２３１２３１２３１５．３６１５．１５１５．１２５．１２５．０５５．０４０．０８

Ｃ１２３２３１３１２１５．８３１４．８５１４．９５５．２８４．９５４．９８０．３３

Ｄ１２３３１２２３１１５．４１５．０６１５．１７５．１３５．０２５．０６０．１１

ｐＨ５．４５４．９４５．００４．９９５．０３５．２０４．９２５．１８４．９２

表４　　　　保加利亚乳杆菌增菌培养基的筛选　（以°Ｔ为结果）试验序号

１２３４５６７８９Ｋ１Ｋ２Ｋ３Ｐ１Ｐ２Ｐ３Ｒ

Ａ１１１２２２３３３８６８２８９２８．６７２７．３３２９．６７２．３４

Ｂ１２３１２３１２３８６８８８３２８．６７２９．３３２７．６７１．６６

Ｃ１２３２３１３１２７５９４．５８７．５２５３１．５２９．１７６．５０

Ｄ１２３３１２２３１８３．５８６８７．５２７．８３２８．６７２９．１７１．３４

°Ｔ２４．５３２．５２９３１２８２３３０．５２７．５３１

表３　　　　保加利亚乳杆菌增菌培养基的筛选（以ＯＤ６００为结果）试验序号

１２３４５６

７８９Ｋ１Ｋ２Ｋ３Ｐ１Ｐ２Ｐ３Ｒ

Ａ１１１２２２３３３１．１７２１．６８５１．９３５０．３９１０．５６２０．６４５０．２５４

Ｂ１２３１２３１２３１．５４４１．４３４１．８１４０．５１５０．４７８０．６０５０．１２７

Ｃ１２３２３１３１２０．９９３１．６４９２．１５０．３３１０．５５００．７１７０．３８６

Ｄ１２３３１２２３１１．５６３１．５１５１．７１４０．５２１０．５０５０．５７１０．０６６

ＯＤ６０００．１６０．３２６０．６８６０．６０００．６８００．４０５０．７８４０．４２８０．７２３

图１的ＯＤ曲线可反应活菌数的变化情况。由图１可知，保加利亚乳杆菌在增菌培养基中的ＯＤ值均较基础培养基大，说明增菌培养基的活菌数明显高于基础培养基。在增菌培养基ＯＤ曲线上，０～８ｈ内ＯＤ

变化较

综合乳酸菌的活菌数及菌活力可知：增菌培养基的最适配方Ａ３Ｂ３Ｃ２Ｄ３。即麦芽汁体积分数为１０％。番茄汁体积分数１０％，ＣａＣＯ３的质量分数为０．０５％，乳糖的质量分数为１．０％。２．２

保加利亚乳杆菌增菌培养基生长曲线的测定以及与基础培养基对比研究

本文详细研究了乳酸菌在增菌培养基中的生长情况，以寻找乳酸菌冻干取样的发酵最适收获期，并与基础培养基进行了对比研究。结果见图１～３。

※基础研究食品科学

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基础培养基，另加入乳糖、生长促进剂、ｐＨ控制剂等物质，通过Ｌ９（３４）正交实验，分别从活菌数和菌活力两方面综合考虑得出的冻干保加利亚乳杆菌最适增菌培养基，经试验可知增菌效果明显，其活菌数高达３．９６×１０１１ｃｆｕ／ｇ，是基础培养基的２０２倍。ＯＤ值（０．９２２）和滴定酸度（５０°Ｔ）分别是基础培养基的５．６倍和１．３倍。３．２

冻干保加利亚乳杆菌最适发酵收获期的确定菌种发酵的收获期（即菌龄）对冻干菌种的存活率也有影响。有资料报道，细菌冻干对数生长期后期、稳定期初期的细胞对冻干的敏感性会大大降低，其存活率高于对数生长期初期和衰老期细胞［５］，尤其是保加利亚乳杆菌宜在稳定期初期收获［４］。通过本试验发现，发酵１８ｈ后菌种处于稳定期，故最后确定菌种发酵的最适收获期为１８ｈ。４４．１

结　　　　论

保加利亚乳杆菌的增菌培养基为ＭＲＳ基础培养

缓慢，表明菌种处于延迟期；８～１６ｈ，ＯＤ值猛增，菌种大量生长繁殖，表明菌种处于对数生长期；１９～３０ｈ，曲线趋于平缓，表明菌种生长进入了稳定期。

图２、图３的°Ｔ和ｐＨ可反应菌活力的变化情况。菌活力强，代谢旺盛，就会产生大量的酸。由图２、图３　可看出，增菌培养基菌的°Ｔ和ｐＨ均分别大大地高于和低于基础培养基，说明增菌培养基中的菌活力明显大于基础培养基。分析增菌培养基的°Ｔ曲线，在０～１０ｈ，°Ｔ变化缓慢，表明菌种处于延迟期；在１０～１８ｈ，°Ｔ增幅较大，表明菌种处于对数生长期；１８ｈ以后曲线趋于平缓。分析增菌培养基的ｐＨ曲线，在０～１８ｈ，ｐＨ下降迅速，这段时间内菌种活力旺盛，在１８－３０ｈ，ｐＨ变化不大，曲线走势平缓。

另外，由图２、图３还可知菌种在增菌培养基中比基础培养基产酸快，发酵初期即可产生大量酸类。可节约发酵时间，缩短发酵周期。

综合图１、图２、图３可知，保加利亚乳杆菌在增菌培养基的ＯＤ、°Ｔ和ｐＨ随时间变化的趋势基本上一致，可以初步确定０～１０ｈ为延迟期，１０～１８ｈ为对数生长期，１８ｈ以后为稳定期。有资料报道［４，５］，在对数生长期后期和稳定期前期收获菌种可以提高菌种的冻干稳定性，故本文确定保加利亚乳杆菌发酵最适收获期为１８ｈ。３３．１

讨　　　　论

冻干保加利亚乳杆菌最适增菌培养基的筛选

组分合理的增菌培养基可以使乳酸菌大量增殖，提

基，麦芽汁体积分数为１０％，番茄汁体积分数１０％，乳糖的质量分数为０．５％，ＣａＣＯ３的质量分数为０．０５％。４．２

保加利亚乳杆菌的最适收获期为发酵１８ｈ，此时为对数生长期后期，活菌数为３．９６×１０１１ｃｆｕ／ｇ，ＯＤ值为０．９２２，菌活力为５０°Ｔ、ｐＨ４．４６。４．３

增菌培养基增菌效果明显，经增菌培养基培养所得活菌数是基础培养基的２０２倍，且菌活力也较基础培养基强，ＯＤ值和滴定酸度分别是基础培养基的５．６倍和１．３倍。

参考文献：［１］

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张兰威，　鄂志强，　万海峰，　等．　乳酸菌增菌培养剂筛选及干燥保护剂的选择［Ｊ］．　中国乳品工业，　２０００，　（２）：　７－１０，１８．［３］

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张建友，　李艳武，　赵群波，　等．　冻干乳酸菌菌种增菌培养基的优化［Ｊ］．　

中国乳品工业，　２００２，　３０（５）：　４０－４３．

高冻干菌种存活率。目前增菌培养基大致分为配制培养

基、乳基质培养基、乳清基质培养基等。由于乳清蛋白易发生热变性而沉淀且菌种在乳基质和乳清基质培养基中增殖慢或不易分离菌种，故较少采用乳基质培养基和乳清基质培养基［６，７］。

乳酸菌增菌培养基配方设计中营养要求复杂，影响生长的因素多，本文仅对其配方进行筛选，以ＭＲＳ为