反相高效液相色谱的基本原理及其应用
反相高效 液相色谱 的基本隐理技 其赢 甬
20 0 8年第 3朝
反相 高效液相色谱 的基本 原理及 其应用
刘桂洋 I ,毛香菊 2 ’ ,陈晋阳 1 ( .: 1I + 海人学 化境 化学T程学院 ..海 2 10 ;2武汉大学 化学 分 子科 学学院, 湖北 武汉 4 0 7 ) j 【 : 080 . j 30 2
摘
要 :高效液相色 经过 3 0年的发展 , 色谱理论研究 、仪器研究水平 、分析实践 用等方面 ,已经取 生物 化学和生物
得 长足 的进步 。本文主要介绍 J反相 商效液相色讲 的 本原理和特 点,以及影 响冈素,并对 ,
T程 中 的应 用 , 环 境 l 中 的心 用 ,在 精 细 有机 合成 中 的 用 进 行 了举 例 。 测 关 键 词 :反 相 高效 液 相 色 谱 ; 保 留值 ; 液相 色 谱 的应 用
中图分类法 :06 7 + 5. 2 7
文献标识码 :A
1 前言 11 反相 高 效液相 色谱 简 介 . 随着 高效 液相 色谱 的快 速 发展 , 各种 新 的色谱 技 术不 断涌现 。其 中 ,反 相 高效 液相 色谱 冈其 良好
的选 择性 ,应 的范 罔不 断扩 人 ,显示 出很 好 的应
用前 景 【。 5 】
更J‘ 。 泛 1 反相键 合 相色 谱法 的分离 原理 1l . 2 6O ~l 住 反 相 键 合 相 色谱 法 中 仲 的 是 1极 性 键 合 卜 定 相 。它 是 将全 多孔 ( 薄壳 )微 粒砖 胶载 体 , 或 经 酸活 化处 理后 与含 羟 基链 ( 4 8 l)或苯 基 C 、C 、C 8
的硅烷 化 试剂 反应 ,生成表 面 具有烷 基或 苯基 的非 极 性 定相 。如共 价 结合 剑载 体上 的谯链 碳氢化 合 物 正辛 基等 。
反 相 高效 液相 色 谱 是化 学 键 合 相 色 谱 法 的 一 种 。化 学 键合 相 色 谱 法 是 由液 液 色 谱 法 发 展 起 米
的,是为 了解 决在 分 离过 中 ,机械 吸 附在 载体 上
的 体液 的流 失 问题 而 发展 出来 的一 种新 方法 。键
关 r反 相色谱 的分 离机理 ,吸 附色 谱的作川 i
制 认为溶 质 在 定相 上 的保 留主 要是疏 水作刚 ,在
合 相 色 谱法 通 过 将 不 同的 有 机 官 能 团通 过 化 学 反
高 效液相 色 谱 中义被 称 为疏溶 剂 作用I】 t。根据 疏溶 剂 理论 , 溶 顷分 子进 入极 性 流动相 后 ,即 占据流 动相 中相 应 的 间 ,而排挤 一 部分溶 剂 分子 。 溶 质 分子 被流动 干 推动 与 l 定相 接触 时 ,溶质 分子 的 H 卉 I 极 性 部 分或 计 极性 冈 子会 将 一 极 性 『 定 相 上 附 1 卉 l
应共 价键合 到砗 胶载 体表 面 的游 离羟
基上 ,而生 成
化学 键 合同定相 。化 学 键合 定相对 各 种极性 溶 剂
都有 良好 的化学 稳定 性和 热稳 定 性 。由它制 备的色 谱 主柱 效 高、使刚 寿命 K、重现 性好 ,几 乎对 各种 类 型 的有机 化合物 都 现 良女 的选 择性 , 可 川 丁 『
梯 度洗 脱操 作 ,消除 了分 配色 谱法 的缺 点 。 根 据键 合 定相 t 动相 相对 极性 的 强弱 , 流 可
着 的溶剂膜 排 挤开 ,而直 接与 极 性 定相上 的烷
基 官能 团相 结合 ( 附 )形成 缔合 络合 物 ,构 成单 吸 分子 吸附层 。这 种疏 溶剂 的 吸 附作川是 可逆 的 ,当 流 动相 极性 减少 时 ,这种 疏溶 剂斥 力 卜 ,会 发生 降
将 键 合 色 谱法 分 为 正相 键 合 色 谱 法 和 反 相 键 合 色 谱 法 。反相 键合 色谱 法 即反相 高 效液 相色 谱 。在 正
解 缔 ,并将溶 质分 子 解放 而被 洗脱 。米 。上述疏溶 卜
相键合色谱法中,键合l定相的极性大于流动相 的 古 J
极 性 ,适J 丁分 离油溶 性或 水 溶性 的极 性和 强极 性 { j
化 合物 。在 反相 键合 相色 谱法 中 ,键合 固定相 的极
剂作用机制可如 图 1 所示。
反相 色 谱 中疏 水 性 越 强 的 化 合物 越 容 易 从 流
动 相 中挤 出去 ,在 色 谱柱 中滞 留时间也 K,所 以反
性 小 于流动相 的极 性 ,适 用 于分 离 非极性 、极性 或
相 色 谱 法 中不 同 的化 合 物 根 据 它 们 的疏 水 特 性 得
离子型化合物 , 其应用范围也 比正相键合相色谱法
.
到分离。反相色谱法适 丁分离带有不同疏水基团的
2 2.
一
宁泼亿 7 Ni b h mi ln ut 7 n o e c Idsr . g C a y
20 0 8年第3朝
化 合物 ,亦 即非极 性基 团的化 合物 。此 外 ,反相 色
溶 的有机 溶 剂 ,以得 到不 同强 度 的流动相 ,这些有
谱 法可 用丁 分离 带有 不 同极性 基 团 的化 合物 。可 以 通 过 改变 流 动相 的溶剂 及 其 组 成和 p H, 以影 响溶 质 分 子 与 流 动 相 的 相 互 作 用 , 改 变 它 们 的 滞 留行
机 溶剂称 为 修饰 剂 。反相色 谱 中最 常用 的有机溶 剂 有 甲醇和 乙腈 , ̄ # ,乙醇 、四氢呋 喃 、异 丙醇及 LI -
二 氧六环 也 常被用 作 修饰 剂 。
为 。另外,反相色谱 中水的流动相中占的比例伸缩
性 很 人 ,可 以从 010 ,从 而 使 反相 色 谱可 用 于 .0 % 水 溶性 、脂溶 性化 合物 的分 离 。反相 色谱 法 中的 同
定 相 是被 共价 结 合 到硅 胶 载 体上 的直 链饱 和 烷烃 , 其链 的 长短不
同,最 K的是 十 八烷 基 ,这 也 是使川
1 影响溶质保留值 的三个因素 . 3
烷 基 键 合 固定 相 对 每 种 溶 质 分子 缔 合 作 川和 解 缔作用 能 力之差 ,就 决定 了溶 质分 子在色谱 过程 的保 留值 。 以下简 述 影 响溶质 保 留值的 二个 冈素 :
1 溶 质分 子结 构 )
得 最 多的 l定相 。直 链饱 和 烷烃 疏水 特 性 随着 碳氢 古 J 链 的 长度 而增 加 ,在 反相色 谱 柱 中溶质 由于疏
在反相键合相色谱法中,溶质的分离是以它们
的疏 水结 构差 异 为依据 的,溶质 的极 性越弱 ,疏水 性也 强 ,保 留值 越 大 。根 据疏 溶剂 理论 ,溶质 的保 留值 与其 分子 中 非极 性部 分 的总表 面积有 关 ,其与
烷 基键 合 同定相 结 出 的面积 愈 人 ,保 留值越 人 。
2 烷 基键 合 同定 相 的特性 烷 基 键 合 固 定相 的作 用 在 丁提 供 非极 性 作 刖
表 面 ,因此键合 到 硅胶 表面 的烷 基数 量就 决定着溶
质 容量 网 子的大 小 。烷 基 的疏 水特性 随碳 链的加 长 而 增加 ,溶质 的保 留值 也 随着烷 基碳 链 K度 的增加 而 增人 。随着烷 基 碳链 的增 ,增加 了键 合相 的1 卜
极 性作用 的表面 积 ,其不 仅影 响溶质 的保 留值 ,还
影 响色谱 柱 的选择 性 ,即随 烷基碳 链 的加 K其 对溶
质分离的选择性也增大。
3 流动 相性 质 )
图 1 反相色谱 中固定相表面上溶 质分子与烷基键合相之 间的缔合作用
注 : 实心箭 头表 示缔 合 物 的形成 :空心 箭 头表 示 缔合物 的 解缔 。 1 为溶 剂膜 : 2为非极 性 烷基键 合相 :3为溶 质 分 子的 极性 官能 团部 分 : 4为溶质 分子 的非 极性 部分 。
流 动相 的表 面 张力 愈人 ,介 电常数 愈人 ,其极 性越 强 ,此 时溶 质 与 烷 基键 合 相得 缔合 能 力越 强 ,
流 动相 的洗 脱强 度 弱 ,导致溶 质 的保 留值越 大 。
2 应 用举 例 水 作 刚 而滞 留 的时 间也 将 随着 碳 氢 链 的 K度 而 增 加 。在 一般情 况 卜 这意 味着 川碳 氢 链 K的反 相色谱 柱能得 到较 好 的分辨 率 ,在 多数 情 况‘ 是依 靠反 复 F 试验选 择色谱 柱 。由 丁反 相 色谱 法 的 定相 是疏水 的碳氢 化合物 ,溶质 与 l定相 之 间 的作用 主要 是 古 l
极 性相 互作刚 ,或者 说疏 水 相互 作用 ,冈此 溶 剂 的
随着技术的不断改进 , 反相高效液相色谱法获
得 日益广 泛 的应用 ,在 高效 液相 色谱法 中也 占有重
要 的地位 1]3 1[] 21 。
白冬梅 等 人 提 出 了一 种 利用 反 相 高 效液
相色
谱法分析米根霉乳酸发酵液中有机酸的方法【 。 一 应 ]
用 反相 Waoi I5 8 S色 谱 柱 ,以 0Omo/ k s.I C1R l .l l L 磷 酸(H25作 为流 动相 , P . ) 发酵液 经稀 硫酸 预处理后
强 度 随着 极性 降低 而 增 加 。水 是 极 性最 强 的溶剂 , 也 是反相 色谱 中最 弱 的溶 剂 。在 反相 色谱 中常 常用 作 基础溶 剂 ,向其 中加入 不 同浓度 的 、可 以与水 混
直接进样分离定量, 1 n内把其 中的乳酸、 在 0 mi 苹
果酸 、富马酸 等完 全 分离 定量 ,各种 酸回 收率大 于
宇 纪一 . 3. 2
反 指 高 效波 桶色 谱的 蕞 奉 理 及 其陂
2 0 第 3期 0 8年
9 % 。 7
使 性质差 别较 大 的维 生素 都 能得到 良好 分离 ,使川
其实验 结果 证 明,该方 法 能将米 根霉 乳 酸发 酵 液 中乳 酸 、苹 果酸 和 富 马酸 完 全分 离 并准确 定 量 。
本方 法具有 前 处理简 单 、干扰 小 、灵敏 度 高、分 析
价格便宜的甲醇. 水为流动相 , 通过改变 p H值等色
谱 条什 ,短 时 间 内实现 了 上述 6种 维 生 素的分 离 。
该 法操作 简便 、迅 速 、 可靠 、测试 费刖 低 。 在环 境 分析 中 ,带硝 基 的有 机化合 物被 广泛地 ‘
用 于制造 火药 ,这类 化合 物 的人 量使用 对环境 造成
速度 快等优 点 ,对 于及 时测 定 乳酸 发酵 过程 的变化 具有 重要意 义 ,是测 定 乳酸 发酵 液 中各有 机酸 的快
速 、有效 的定量 测定 方法 。
严 重 的污 染 。虽 然气 相 色谱法 中常川 的各类选 择性
检 测 器对 丁这 类 化 合 物 的检 测 有 很好 的选 抒性 及
很 高的灵敏 度 ,但 由 丁这 类化 合物 的热 不稳 定性给
盐上
图 2 标准有机酸混合液在不同流动相条件下的分离色谱图
注 :a 表示 流动 相为 00 o/ 的 P p 25:b表 示流 动相 为 .1 l m L O (H . )
0 1 l 的 K 2 O (H ) c 表 示 流 动 相 为 00 m l 的 . mo L 0 / H P 4 25 : p . 1 o/ L
定量 测定带 来 困难 ,因此 常选 用液 相色谱 法分 离检
测 。E mmr h等人 发 展 出 丁 T ̄i, ,,3 5二 i c N l, 】 , /- 氢
硝 基 一 , 3 5 二 嗪 ( D l , . R X)及 其 重要 衍生 物 的 HP C二极 管 阵列 分 离测 定 方法 ,这 一方法 不仅 可 L 以对这 些化 合物 定量 ,而 且可 以对 被测 定的化 合物 提 供定 性信 息[】 3是 T T和 R X及其 衍 生物 1。图 7 N
D
的典 型分离 色谱 图 。
N 4 2O (H ) H H P 4 25;d表 流 动 干为 00 5 l 的 H S 4p ) 1 p H .0mo/ L 2O (H2 。 为 5
.
酸 :2为苹 粜酸 :3为乳 酸 :4为乙酸 ;5为柠檬 酸 :6为寓 酸 。 j
目 前,获得紫杉醇 比较可行 的方法是从红豆杉 中进行提取分离,但由于红豆杉中紫杉醇的含量很
低 , 且存在 很 多与紫 杉醇 结构 利性 质 非常接 近 的
紫 杉烷 伴 生物 ,如 二尖 杉 碱 , 这 种结 构 上 的细 j 微 差别 使得 紫 杉醇 和 二尖 杉 宁碱 的分 离 十分 难 。
雒 丽娜 等人 采 J 正 相 色谱 和 反 相 色 谱法 相 结合 的 { j
方 法 ,在 反 相 色 谱 中 使 川 了一 种 新 颖 的 高 分 子填 料 ,成功 分离提 纯 了紫 杉醇 1 尖杉 碱 ,纯度 达 三
剑 9 %以上 , 克服 了传 统方 法 的缺 点I】 8 l。 5 李米 生 等 人 采 用 反 相 色 谱 法 同 时测 定 食 品 中
水 溶 性维 生 素( i mi C、 B 、B 、 B 、B 和 B1 Vt n a ) 5 6 l 2 2
O 2 O 40
的含 量【】 1 ,采 用 P 8 1/ 5 440mm×2 0m 6 C .OS2 0 (. 5 m,
l m) ,01 l 0u 柱 .mo L甲酸铵. / 甲酸溶 液(H 45 p = .,含
图 3 X和 T RD NT及 其衍生物的反相色谱分离图
0 %二 乙 胺 ) 醇 (5 2) 流 动 相 , 流 速 1 . 4 +甲 7+5 为
ml n v 24n / ,U 5 m,l i mi 2r n内实 现 了 良好 分 离 , a 高 如瑜 等 人 介 绍 了用 反 相液 相 色 谱 法 定 量分 析三 苯基磷 【】 l。采用 反相液 相 法 ,使 c8 学键 8 l化 合 硅胶 柱 ,用 乙腈 溶解 样 品 ,用 8%以上 甲醇 ,水 0 为流动相 ,流速 为 1 / n . ml ,紫外 检测 器 ,波 长 5 mi
乙酰苯胺为 内标物 。苹果及强化奶粉中维生素平均
回 收率 分 别 为 9. %一0 . %5 5 0 ̄128%, 25 l5 0 19.  ̄ 0. 0 6 3 0/ 0
此试验采用选择性较高的 c 固定相 ,作用力适中,
.
2 . 4
’
N n b hmi ln ut ig oC e c Id s y a r
20 08年第 3 期
24n 5 m,得到 了峰 形对称 ,重现 性好 的分 离 图。我
们 将此 方 法 川 丁二 苯 基 磷 生 产 的 艺条 件 选 择 和
泛应用 ,相信会 有 更好 应, 前 景 。 } _ I j
参考 文献 :
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出 版 社 【 】 2 0 .. M , 0 11
生 产质量 的 定量测 定 ,得 到 满 意 的结果 。本方 法适
用 丁 业 二苯 基磷 产 品 的定量 分析 。 J 由 丁手性 化合 物 的物理 、化 学性 质 相 同 ,实现
它们 的分离就 比较 困难 ,如 人 多数氨 基酸 都有 右旋
体 和左旋 体 ,但往 往 只 能获 得右 旋体 和左 旋体 的混 合 物 ,即外消旋 体 。对 手 性药 物往 往 现一 种对 映体 ( R)具 有 强 的生物 活 性 I 效 ,而 另一 种 对 药
映 体 ( )却 无 药效 ,冈此 对 手性 药 物 对 映体 的拆 S
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南——~
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t n /
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图 4 心 得 安 对 映 体 在 手 性 固体 相 上 的 分 离
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通过 以上例 子 ,可 以看 山反相 高 效液 相色 谱法
通 过 将 不 同 的有 机 官 能 团通 过 化 学 反应 共 价键 合
[4 自冬梅,赵学明,胡宗定. 1] 应用反相商效液相色 法
测 定米根霉 乳酸发酵 液中的有机 酸f1 J .T业微 生物 ,
2 01 : ~l . 0 . 8 1 3
到硅 胶载 体表 面的游 离 羟基 上 ,而 生 成不 同极 性 的 化 学键合 『定相 ,从而 使 这种 方法 的选 择性 得 剑提 古 J
高且 具有 针对性 。反相 高 效液 相色 谱所 具有 的 柱效
[5 雒丽娜等. 相色谱和反相色 法分高提纯东北红豆 1] 『 F
杉 中紫 杉 醇 和 三 尖 杉 宁碱 I .分 析 化 学学 报 ,2 0 ,2 J 】 0 6 2
( )1 - 0 1:7 2 .
高 、使 用寿 命长 、重现 性好 ,几乎 对各 种类 型 的有 机化 合物 都呈现 良好 的选 择 性 ,并 可用 于梯 度洗 脱 操作 的优 点 ,使得 在 生物 化 学 与 程 ,医 药研 究 , r 食 品分析 ,环 境污 染利 精细 化 l等 领域 都得 到 了广 _ l
( 下转第 5 0页 )
宁波化I
. S. 2
信
息
20 0 8年钨3期
涂料涂覆 标记 》等五 项标准 已于 7月份报批
由国家 安全 生产 监 督管 理总 局提 出的一项 A Q标准 制订 项 目 《 油漆 与 粉刷 作业 安全 规程 》 ( 安监 总政
法 (0 7 6号通 知 )送 审稿 ,四项 G 2 0 )9 B标 准修 订项 目 《 涂装 作业 安全 规程 术语 》 ( 0 6 6 卜T 4 0 2 0 2 2 一 5 )、
《 涂装 作业 安全规 程 粉末 静 电喷涂 安全 》 (06 77 Q4 0 《 装作 业 安全 规程涂 漆 艺安全 及 L艺 20 29一 一5 )、 涂 其 通风 净化 》 (0 6 87 Q4 0 2 0 17一 一 5 )、 《 涂料 涂覆 标记 》 (0 6 15T 40 20 15 一一 5 )经 本分 标 委会 组织会 议审查
通 过 。根据 审 布会议 要 求 ,经 修 改完 成报 批稿 ,已丁 2 0 08年 7月 2 2日将报批 稿 及 有关 材料 上报给 全 国安全 生产 标准化 技术 委 员会 。
( 甬涂 报 导)
标准化 工作科 学发展座谈会在 京 召开
1 0月 1 4日国家标准 委 在京 开标 准化 i作 科学 发展鹰 谈会 。国家质 检 总局 党组 成 员 、国家标准 委主 / 任 纪 正 昆在座 谈会 上 指 出要牢 I 立 3个 观念 :一是要 牢 树立 服 务观念 ,明确标 准化 .作 的指 导思想 和 刮树 I :
定位,倡导 “ 三个服务 ”即标准化T作必须服务于经济建设、服务于社会需求 、服务于科学发展;二是要
牢 固树立 科 学的观 念 ,解 决工 作方 式方 法 的 问题 ,在 工作 中要坚 持科 学 、客 观 、公正 、协调 的原 则;二 是
牢 同树立 法制 观念 。 纪 正 昆提 出,当前 要抓 好 3什 人事 :一 是制 定好 国家技 术标准 战 略发 展纲 要 ,作 为今后 全 国标准 化
作科学发展的纲领和方向; 是进一步健全和完善国家标准体系 ,形成系统完善 、重点突山、层次分明、 相互衔接 、适应国家经济建设和社会发展需要的国家标准体系;三是尽快修改出台新的 《 标准化法》 ,拓
展法 的调整 范 围 ,更好 地对 标准 的制定 、 实施和 监督 实行 法制 管理 。
( 俊玲) 陈
(I 第 2 转 5页 )
[6 1 ]李来生,张江华. 反相高效液相色 法测定食品中水
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S c 1 9 , 2 4 7 . o . 9 0 1 : 5 3 1
[7 1 3靳东门. 反相色潜 环境分析中的心用『 ,中山人学 J l
学 报 论 从 . 0 2 1 )l6 2 0 0:  ̄ . (
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a a dC e cl n ier g S ag a Unv ri , h n h i 0 0 1 h o vr me tl n h mi gn ei h n h i iesy S a g a, 0 ; S oE o aE n t 21 8 2S h o f e c l n oe ua ce c , u a iest, h n Hu e, 3 0 2 .c o l mia dM lc lr in e W h nUnv ri Wu a , b i4 0 7 ) o Ch a S y
Abs r c : tr 0y asd v lp n , HP C a d ra rv me ti etr s f ho tga h e r td ta tAfe e r e eo me t 3 L h sma eage t mp o e n t m r mao rp yt oysu y, i nh e oc h
i sr me tlr s a c n n l t a p l . h sa t l f c s so e f n a n a h o y a d f a u e fr v re h a e HP C. n tu n a e e r h a d a ay i la p y T i ri e o u e n t u d me t l e r n e t rs o e e s d p r s L c c h t
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